Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.
Automatizovaná analýza textů nebo dat ve smyslu čl. 4 směrnice 2019/790/EU a použití této knihy k trénování AI jsou bez souhlasu nositele práv zakázány.

prof. MUDr. Edgar Faber, CSc., a kolektiv

Základy hematologické diagnostiky
3., přepracované a doplněné vydání

Editor:
prof. MUDr. Edgar Faber, CSc.
Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

Kolektiv autorů:
MUDr. Martin Čerňan, Ph.D.
prof. MUDr. Edgar Faber, CSc.
MUDr. Dana Galuszková, Ph.D., MBA
MUDr. Veronika Hanáčková
MUDr. Antonín Hluší, Ph.D.
MUDr. Iva Holusková, Ph.D.
Mgr. Jarmila Juráňová
MUDr. Zuzana Kubová
MUDr. Jiří Masopust
prof. MUDr. Mgr. Jiří Minařík, Ph.D.
RNDr. Martin Novák, Ph.D.
MUDr. Aleš Obr, Ph.D.
MUDr. Tomáš Pika, Ph.D.
prof. MUDr. Vít Procházka, Ph.D.
MUDr. Renata Procházková, Ph.D.
doc. MUDr. Peter Rohoň, Ph.D.
doc. MUDr. Tomáš Szotkowski, Ph.D.
Mgr. Helena Urbánková, Ph.D.
MUDr. Jana Zuchnická

Recenzenti:
prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc.
Interní hematologická a onkologická klinika a Oddělení klinické hematologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno

prof. MUDr. Vlastimil Ščudla, CSc.
III. interní klinika – nefrologická, revmatologická a endokrinologická Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

První vydání publikace bylo podpořeno Evropským sociálním fondem v operačním programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost v rámci řešení projektu CZ.1.07/2.2.00/07.0294.

Třetí vydání publikace bylo podpořeno grantem Univerzity Palackého IGA_LF_2024_01 a grantem Ministerstva zdravotnictví ČR: MH CZ – DRO FNOL, 00098892.

Kapitola 15 připravena s podporou Projektu Národního ústavu pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID: LX22NPO5102) – Financováno Evropskou unií – Next Generation EU.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

Obrázek na obálce reprodukován se souhlasem autora: olejomalba Jana Knapa „Bez názvu“ z roku 1993.
Obrázky pro třetí vydání dodali autoři. Obrázky 1.1 a 1.2 překreslil a upravil Jiří Hlaváček.
Cover Photo © Jan Knap, 2024
Cover Design © Grada Publishing, a.s., 2024

© Grada Publishing, a.s., 2024

Vydala Grada Publishing, a.s.
U Průhonu 22, Praha 7
jako svou 9319. publikaci
Šéfredaktorka lékařské literatury MUDr. Michaela Lízlerová
Odpovědná redaktorka BcA. Radka Jančová, DiS.
Jazyková korektura Jana Křivánková
Sazba a zlom Monika Vejrostová
Počet stran 364
3. vydání (v Gradě 1.), Praha 2024
Tisk Iva Vodáková – Durab

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění však pro autory ani pro nakladatelství nevyplývají žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-271-7383-9 (ePub)
ISBN 978-80-271-7382-2 (pdf)
ISBN 978-80-271-5032-8 (print)

Kniha vychází s podporou společnosti Novartis

Editor

prof. MUDr. Edgar Faber, CSc.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

Kolektiv autorů

MUDr. Martin Čerňan, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

prof. MUDr. Edgar Faber, CSc.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Dana Galuszková, Ph.D., MBA

Transfuzní oddělení Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Veronika Hanáčková

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Antonín Hluší, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Iva Holusková, Ph.D.

Transfuzní oddělení Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

Mgr. Jarmila Juráňová

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Zuzana Kubová

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Jiří Masopust

Transfuzní oddělení Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem, o. z., Krajské zdravotní, a. s.

prof. MUDr. Mgr. Jiří Minařík, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

RNDr. Martin Novák, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Aleš Obr, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Tomáš Pika, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

prof. MUDr. Vít Procházka, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Renata Procházková, Ph.D.

Transfuzní oddělení Krajské nemocnice Liberec, a.s.

doc. MUDr. Peter Rohoň, Ph.D.

Ústav lékařské genetiky a genomiky Lékařské fakulty Masarykovy Univerzity a Fakultní nemocnice Brno

doc. MUDr. Tomáš Szotkowski, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

Mgr. Helena Urbánková, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

MUDr. Jana Zuchnická

Klinika hematoonkologie Fakultní nemocnice Ostrava

Recenzenti

prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc.

Interní hematologická a onkologická klinika a Oddělení klinické hematologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno

prof. MUDr. Vlastimil Ščudla, CSc.

III. interní klinika – nefrologická, revmatologická a endokrinologická Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a Fakultní nemocnice Olomouc

Předmluva ke třetímu vydání publikace Základy hematologické diagnostiky

Držíte v rukou třetí, upravené a doplněné vydání publikace určené širokému spektru čtenářů – od studentů medicíny a laboratorních asistentů přes zdravotní sestry, praktické lékaře nebo internisty až po hematology. První vydání (vyšlo v roce 2012 ve vydavatelství Univerzity Palackého v rámci projektu OPVK CZ.1.07/2.2.00/07.0294 věnovaného internetové mikroskopické morfologii) se setkalo s příznivou odezvou čtenářů a obdrželo cenu České hematologické společnosti ČLS JEP za nejlepší monografii v roce 2013. Druhé, přepracované vydání vyšlo v roce 2015 ve vydavatelství Mladá fronta. Do současného vydání byly doplněny kapitoly o imunohematologickém vyšetření, průtokové cytometrii, cytogenetice a molekulární genetice a diagnostice potransfuzních reakcí. Další doplňky se týkají například laboratorních přístrojů užívaných přímo u pacienta (tzv. point-of-care testing), nové WHO klasifikace hematologických malignit nebo hematologických projevů infekce covid-19. Publikace nadále zachovává původní koncepci: poskytnout na co nejmenším prostoru dostatečně přehledné a jasné informace nezbytné ke stanovení diagnózy hematologických onemocnění a stavů. To, čím se naše monografie odlišuje od obdobných publikací, je zařazení typických výsledků krevních obrazů, diferenciálních počtů bílých krvinek, koagulačních a případně biochemických vyšetření, ilustrujících jednotlivé diagnózy. Doufáme, že tím poskytneme čtenáři důležitý článek spojující teorii a praxi. Hematologie je příkladem relativně úzce specializovaného oboru vnitřního lékařství s řadou přesahů do dalších oblastí medicíny, který kontinuálně prodělává markantní rozvoj. Naakumulované poznatky o patogenezi onemocnění krve vyústily v léčebné postupy, které často zásadním způsobem změnily prognózu nemocných. Doufáme, že naše publikace Vás bude motivovat k dalšímu studiu tohoto nesmírně zajímavého oboru.

V Olomouci, červenec 2024

prof. MUDr. Edgar Faber, CSc.

1Principy vyšetření krevního obrazu

Jarmila Juráňová

Vyšetření krevního obrazu (KO) patří mezi základní laboratorní (hematologická) vyšetření. Výsledky KO přináší lékaři jednu z prvních informací o zdravotním stavu pacienta a jsou nezbytné pro stanovení diagnózy a monitorování léčby (ze screeningového vyšetření se často stává vyšetření diagnostické).

Vyšetření se provádí z nesrážlivé krve. Periferní krev pacienta se odebere do zkumavky s protisrážlivým činidlem (soli kyseliny etylendiaminotetraoctové K3EDTA, popř. K2EDTA).

KO se stanovuje na hematologických analyzátorech krvinek. Některé z parametrů KO se měří na analyzátorech přímo, jiné se zjišťují výpočtem z hodnot měřených parametrů.

Dále jsou uvedeny základní parametry krevního obrazu měřené na hematologickém analyzátoru.

1.1Červené krvinky (erytrocyty)

Přímo měřené parametry:

RBC – počet erytrocytů (red blood cells) v litru krve, je závislý na pohlaví (vyšší hodnoty u mužů než u žen), věku, rase a dalších faktorech (např. způsob výživy, nadmořská výška). Je udáván v jednotce 1012/l.

HGB – hemoglobin udává množství krevního barviva v krvi, informuje o tíži anemie (lehká, středně těžká, těžká). Je stanovován v jednotce g/l.

Přímo měřené nebo vypočtené parametry:

HCT – hematokrit je poměr objemu erytrocytů k celkovému objemu krve, informuje o hustotě krve/stupni hydratace. Měří se buď přímo (jako integrál impulzů), nebo se vypočte dle vzorce:

HCT je udáván jako bezrozměrné číslo (poměr, ratio).

MCV – střední objem erytrocytu (mean corpuscular volume) je průměrný objem buňky v hodnocených erytrocytech. Přináší základní informace o druhu / možné příčině anemie. Je to parametr důležitý pro diferenciální diagnostiku anemií. Dle MCV se dělí anemie na normocytární, mikrocytární či makrocytární. Je udáván v jednotce femtolitr (fl) a měří se buď přímo, nebo se vypočte dle vzorce:

Vypočítané parametry:

MCH – střední množství hemoglobinu v erytrocytu (mean corpuscular hemoglobin) je průměrná hmotnost hemoglobinu v jedné červené krvince. Dle MCH se dělí anemie na normochromní, hypochromní a hyperchromní. Jednotkou jsou pikogramy (pg), vypočítá se ze vzorce:

MCHC – střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytu (mean corpuscular hemoglobin concentration) je průměrná koncentrace hemoglobinu v erytrocytu. Slouží ke zhodnocení normochromie, hypochromie a hyperchromie podobně jako MCH. Jednotkou je g/l (popř. g/dl) a vypočítá se ze vzorce:

Mezi přímo měřené parametry patří také:

RDW – distribuční šíře erytrocytů (red cell distribution width), popisuje šíři nejčetnější populace erytrocytů v KO, stanovuje se jako variační koeficient (CV) v procentech (%) a/nebo jako směrodatná odchylka (SD) ve femtolitrech (fl). Informuje o izocytóze (homogenní populace erytrocytů) nebo anizocytóze (nehomogenní populace erytrocytů) v KO. Zvýšené hodnoty RDW (nad 15,2 %) ukazují na významnou anizocytózu (nehomogenitu objemů měřených erytrocytů).

RET – retikulocyty jsou mladé červené krvinky obsahující zbytky RNA, odráží dynamiku změn v počtu erytrocytů, stanovují se relativně v podílu k celkovému počtu erytrocytů (podíl jednotky) a/nebo absolutně (109/l). Snížené hodnoty RET ukazují na anemie z nedostatečné produkce erytrocytů, zvýšené hodnoty RET pak na anemie ze zvýšených ztrát erytrocytů. RET lze měřit přímo na analyzátorech (současně s měřením dalších hodnot KO). Při anemiích je vhodné tento výsledek korigovat na hodnotu normálního hematokritu, což poskytuje přesnější informaci o proliferačních možnostech kostní dřeně, jež jsou oslabeny např. při útlumech krvetvorby (viz kapitola 11). Korigovaný počet retikulocytů (retikulocytární index RI) se vypočítá vynásobením počtu retikulocytů (RET) poměrem zjištěného a normálního hematokritu (HCT):

1.2Bílé krvinky (leukocyty)

Přímo měřené parametry:

WBC – počet leukocytů (white blood cells) v litru krve, je udáván v jednotce 109/l.

DIF – analyzátorový pětipopulační diferenciální počet leukocytů (rozpočet leukocytů, analyzátorový diferenciál), je podle subpopulací leukocytů (neutrofily, eozinofily, bazofily, monocyty, lymfocyty) vydáván absolutně v jednotkách 109/l a relativně v procentech (%).

1.3Krevní destičky (trombocyty)

Přímo měřené parametry:

PLT – počet trombocytů (platelet) v litru krve, je udáván v jednotce 109/l.

MPV – střední objem trombocytů (mean platelet volume), je udáván v jednotce femtolitr (fl).

Vypočítané parametry:

PDW – šíře distribuce trombocytů (platelet distribution width), jednotkou jsou femtolitry (fl) nebo procenta (%).

PCT – destičkový hematokrit (platelet hematocrit), je udáván jako bezrozměrné číslo nebo v ml/l.

Nová generace hematologických analyzátorů umožňuje stanovovat spolu s dalšími parametry KO i mladé retikulované trombocyty.

IPF – frakce nezralých trombocytů (immature platelet fraction) je vydávána absolutně v jednotkách 109/l a/nebo relativně v procentech (%).

Vyjadřuje počet mladých (1–2 dny starých) trombocytů, které jsou retikulované (mají vyšší obsah RNA). IPF je markerem produkce trombocytů v kostní dřeni, podobně jako je počet retikulocytů (RET) markerem produkce erytrocytů. IPF je využívána v diferenciální diagnostice trombocytopenií. Pomáhá odlišit trombocytopenie způsobené sníženou produkcí trombocytů (nízká nebo normální hodnota IPF) od trombocytopenie způsobené zvýšenou destrukcí či spotřebou trombocytů (vysoká hodnota IPF).

1.4Principy počítání krevních částic na hematologických analyzátorech

Po nasátí vzorku krve se buňky nejprve seřadí pomocí speciálního systému (hydrodynamická fokusace) za sebou do řady, aby byla počítána vždy jen jedna buňka (eliminuje se tak možná interference buněk). Současně dochází k naředění vzorku krve speciálním ředicím roztokem. Tato suspenze buněk je pak rozdělena do dvou detekčních komor. V jedné komoře se počítají erytrocyty a trombocyty, ve druhé pak leukocyty a jejich diferenciální počet.

Většina analyzátorů krevních částic (vydávající pětipopulační1 diferenciální počet leukocytů) pracuje na základě dvou metod:

•impedanční metoda (slouží pro počítání erytrocytů a trombocytů),

•optická metoda (slouží pro počítání leukocytů, pětipopulačního diferenciálního počtu leukocytů, normoblastů a retikulocytů. Lze jí také počítat trombocyty, např. u trombocytopenických pacientů).

Existují analyzátory, které používají k stanovení počtu trombocytů tzv. imunologickou metodu (využívá specifickou protilátku proti povrchovému antigenu CD61).

Velkou výhodou analyzátorů krevních elementů je skutečnost, že všechny informace získáme z jednoho odběru na vyšetření KO, případně z jednoho náběru analyzátorem.

1.4.1Impedanční princip

Jde o měření odporu (napětí mezi elektrodami) při průchodu elektrického proudu (obr. 1.1).

Obrázek 1.1 Princip impedanční metody

Po nasátí vzorku krve a jeho naředění ředicím roztokem (v příslušném poměru) je suspenze buněk vstřikována do detekční komůrky. Uvnitř detekční komůrky je malý otvor (apertura), po obou stranách apertury jsou dvě elektrody, na ně je přiváděn elektrický stejnosměrný proud. Buňky procházejí vodivým prostředím za využití hydrodynamické fokusace (která seřadí buňky za sebou) skrze aperturu (obr. 1.2). V okamžiku, kdy buňka prochází aperturou, dojde k přerušení proudu mezi elektrodami (zvýší se elektrická impedance) a vznikne impedanční (napěťový) impulz (1 impulz = 1 buňka). Četnost impulzů udává počet buněk, velikost impulzů udává objem buněk. Tyto impulzy jsou dále zpracovávány a vyhodnoceny počítačem. Výsledkem jsou tzv. histogramy (dvojrozměrná distribuce počtu buněk v závislosti na jejich velikosti). Impedanční metodou jsou nejčastěji detekovány RBC a PLT, u problematických vzorků krve lze tyto parametry detekovat optickou metodou.

Obrázek 1.2 Hydrodynamická fokusace, impedanční metoda

PLT – trombocyty, RBC – erytrocyty

1.4.2 Optický princip

Je založen na průchodu laserového paprsku skrze buňku (obr. 1.3). Laserový paprsek dopadá na průtokovou kyvetu, kterou procházejí buňky (za využití hydrodynamické fokusace). Průchozí element je ozářen a rozptyl odraženého paprsku je měřen pod třemi úhly.

Obrázek 1.3 Princip optické metody2

FSC – detektor dopředného rozptylu, SFL – detektor bočního fluorescenčního rozptylu, SSC – detektor bočního rozptylu

Uvnitř analyzátorů se nacházejí detektory, které snímají a analyzují rozptýlené světlo. Tyto světelné signály nesou informace o charakteru buňky, jako jsou její velikost, složení (komplexita), granularita cytoplazmy a členitost (lobularita) jádra, jež se využívají k určení typu buňky. Pokud jsou přítomny atypické elementy, které analyzátor není schopen zařadit, oznámí to pomocí různých hlášení. Takto analyzátor upozorňuje na přítomnost nezařaditelných elementů (na mladší a reaktivní formy buněk, na atypické/patologické buňky nebo pouze na přítomnost holých jader). Analyzátor svá data statisticky zpracovává a pomocí použitých algoritmů pro jednotlivé parametry je i graficky znázorňuje do tzv. scattergramů (grafů, kde jsou hodnoty prezentovány jako jednotlivé barevné body; obr. 1.4).3

Obrázek 1.4 Scattergramy (bodové grafy) ukazující normální distribuci leukocytů3

FSC – detektor dopředného rozptylu, SFL – detektor bočního fluorescenčního rozptylu, SSC – detektor bočního rozptylu

Optickou metodou jsou detekovány WBC, pětipopulační diferenciální počet leukocytů, normoblasty, retikulocyty, nezralé granulocyty; je možné detekovat i RBC a PLT.

Nové moderní hematologické analyzátory jsou dodávány jako celé linky, jejichž součástí je nátěrový a barvicí automat, který dokáže z vybraných vzorků krve připravit obarvené krevní nátěry. Ty lze dále digitálně zpracovávat a hodnotit v zařízení pro digitální zpracování obrazu pod dohledem laboratorního pracovníka (tzv. digitální morfologie). Automatický analyzátor pro digitální morfologii může být rovněž zapojen do hematologické linky.

Referenční meze krevního obrazu pro dospělé jsou dostupné v aktuální verzi na: https://labsekce.hematology.cz/referencnimeze/.

Tabulka 1.1 Fyziologické hodnoty krevního obrazu; referenční meze pro dospělé nad 15 let

Základní hodnoty krevního obrazu

Název

Zkratka

Muži

Ženy

Jednotky

Leukocyty

WBC

4–10

4–10

109/l

Erytrocyty

RBC

4,00–5,80

3,80–5,20

1012/l

Hemoglobin

HGB

135–175

120–160

g/l

Hematokrit

HCT

0,40–0,50

0,35–0,47

ratio (l/l)

Střední objem erytrocytů

MCV

82–98

82–98

fl

Hemoglobin erytrocytů

MCH

28–34

28–34

pg

Střední barevná koncentrace erytrocytů

MCHC

320–360

320–360

g/l

Šíře distribuce erytrocytů

RDW

10,0–15,2

10,0–15,2

%

Trombocyty

PLT

150–400

150–400

109/l

Střední objem trombocytů

MPV

7,8–12,8

7,8–12,8

fl

Retikulocyty

RET

0,005–0,025

0,005–0,025

podíl jednotky

Diferenciální počet leukocytů (analyzátorový)

Lymfocyty (relativně)

Ly %

20–45

20–45

%

Lymfocyty (absolutně)

Ly #

0,80–4,00

0,80–4,00

109/l

Monocyty (relativně)

Mo %

2–12

2–12

%

Monocyty (absolutně)

Mo #

0,08–1,20

0,08–1,20

109/l

Neutrofily (relativně)

Ne %

45–70

45–70

%

Neutrofily (absolutně)

Ne #

2,00–7,00

2,00–7,00

109/l

Eozinofily (relativně)

Eo %

0–5

0–5

%

Eozinofily (absolutně)

Eo #

0,00–0,50

0,00–0,50

109/l

Bazofily (relativně)

Ba %

0–2

0–2

%

Bazofily (absolutně)

Ba #

0,00–0,20

0,00–0,20

109/l

1 Starší generace analyzátorů krvinek vydává třípopulační diferenciální počet leukocytů, který je méně přesný a spíše jen orientační.

2 Princip optické metody u analyzátorů Sysmex řady XN, které využívají technologii fluorescenční průtokové cytometrie.

3 Scattergramy zobrazené analyzátory Sysmex řady XN.

2Příčiny falešných výsledků krevního obrazu

Jarmila Juráňová

Vyšetření krevního obrazu (KO) prováděné na analyzátorech krvinek má svá úskalí a určitá omezení, na která se musí během analýzy krevního vzorku pamatovat. Vzorky mohou obsahovat složky nebo látky bránící přesnému stanovení parametrů KO. Hovoříme o interferenci v KO. Některé interference přímo závisí na vyšetřovací metodě daného analyzátoru (impedanční, optická, imunologická), jiné jsou na způsobu stanovení nezávislé. Poznat tyto rušivé jevy (interferenci) znamená vydávat validní výsledky, naopak nepoznané interference mohou mít negativní důsledky v klinické praxi.

Interference (ovlivňující absolutní počty krevních buněk i diferenciální počet leukocytů) mohou být původu:

•plazmatického (např. kryoproteiny, paraproteiny, lipidy),

•buněčného (např. normoblasty, erytrocyty rezistentní na lýzu, velké trombocyty).

Dále se mohou vyskytnout jevy, které se projeví v přítomnosti některých složek:

•pseudotrombocytopenie,

•aglutinace erytrocytů,

•aglutinace neutrofilů,

•zvýšené hodnoty hemoglobinu při hyperlipemii a hyperbilirubinemii.

2.1Normoblasty

U některých pacientů (např. předčasně narození novorozenci, pacienti s dg. talasemie, osteomyelofibrózy, myelodysplastického syndromu aj.) jsou do periferní krve vyplavovány nezralé jaderné buňky červené řady – normoblasty (erytroblasty, NRBC). Tyto jaderné buňky (jmenovitě polychromní a ortochromní normoblasty) mají stejnou velikost jako lymfocyty.

Při měření leukocytů na analyzátorech krvinek impedanční metodou se do jejich počtu zahrnují všechny jaderné elementy, tedy i normoblasty.

Analyzátor tak chybně považuje normoblasty za lymfocyty a výsledný počet leukocytů je falešně vyšší. Optická metoda normoblasty separuje (od leukocytů) a je schopná vydat jejich absolutní i relativní počet (obr. 2.1).

Obrázek 2.1 Normoblasty

Na obrázcích A a B jsou dva normoblasty, pro srovnání jsou na obrázcích C a D dva lymfocyty. Na obrázku vpravo je scattergram měření normoblastů optickou metodou – oddělení populace NRBC od populace WBC (měřeno na analyzátoru Sysmex řady XN).

FSC – detektor dopředného rozptylu, SFL – detektor bočního fluorescenčního rozptylu, NRBC – jaderné erytrocyty, WBC – leukocyty

2.2Erytrocyty rezistentní na lýzu

Za některých, většinou patologických stavů (dědičné i získané abnormity) mohou být v krvi přítomny RRBC, tzn. na lýzu rezistentní erytrocyty (např. terčovité erytrocyty). Vyskytují se např. u talasemie, hemoglobinopatie, onemocnění jater, u novorozenců (kvůli vysokému fetálnímu hemoglobinu).

Tento fenomén se výrazněji projevuje u analyzátorů krvinek s kratším časem lýzy. RRBC pak mohou ovlivňovat počty krvinek (sníží počet erytrocytů, zvýší počet leukocytů).

2.3Pseudotrombocytopenie

Při stanovení počtu trombocytů na analyzátorech krvinek přítomnost agregátů (shluků) trombocytů falešně snižuje počet trombocytů. V některých případech mohou agregáty trombocytů ovlivnit i počty leukocytů a erytrocytů.

Hovoříme o pseudotrombocytopenii (falešné trombocytopenii) v KO. Ve skutečnosti je v krevním vzorku trombocytů dostatek, jsou však „poshlukované“ a analyzátor není schopen je správně spočítat.

Shlukování může být způsobeno např.:

•nedostatečně promíchaným vzorkem krve s protisrážlivým činidlem (krev je sražená),

•přítomností protilátek proti trombocytům,

•fenoménem EDTA (změny na membráně trombocytů vyvolané přítomností soli EDTA).

Agregáty trombocytů mohou být v nátěru periferní krve přítomny i v rámci autoimunitních onemocnění nebo po některých infekcích.

Snížení počtu trombocytů může způsobit i jev zvaný destičkový satelitismus (soli EDTA ovlivní membránu neutrofilů, která pak může vázat trombocyty na svém povrchu po celém obvodu, a to do tvaru růžice) (obr. 2.2).

Obrázek 2.2 Destičkový satelitismus

U analyzátorů krvinek s impedanční metodou počítání trombocytů mohou počet trombocytů ovlivnit např. makrotrombocyty či fragmenty cytoplazmy leukocytů. Vždy je pak nutná mikroskopická kontrola. Analyzátory krvinek s optickou metodou počítání trombocytů dokáží většinu těchto problémů ošetřit.

Alternativně se dnes k odběru s výhodou využívá zkumavky s ionty magnesia (ThromboExact). Toto médium by mělo pseudotrombocytopenii eliminovat (zaručit, že se trombocyty „neposhlukují“), zároveň zde nedochází k ovlivnění hodnot ostatních parametrů KO. V některých případech však nelze ani při odběru do média ThromboExact tento jev zcela eliminovat, proto je u prvozáchytu vzorků s trombocytopenií nutná mikroskopická kontrola (obr. 2.3).

Obrázek 2.3 Výsledky měření krevního obrazu z odběru do zkumavky EDTA a z odběru do zkumavky ThromboExact včetně mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve (přítomnost a nepřítomnost shluků trombocytů). Dva zároveň odebrané vzorky jednoho pacienta.

Poznámka:

Literatura popisuje také jev zvaný pseudotrombocytóza. Na rozdíl od pseudotrombocytopenie se tento jev vyskytuje vzácně např. u pacientů s těžkými popáleninami. Vlivem tepla dochází k narušení membrán erytrocytů a vznikají malé erytrocyty (mikrocyty), mikrosférocyty, fragmenty erytrocytů podobné schistocytům (mající velmi různorodé tvary). Zároveň je v krevním nátěru patrná výrazná anizopoikilocytóza erytrocytů. Všechny tyto buňky mohou být analyzátory krvinek nesprávně počítány jako trombocyty. Dochází tak k falešně zvýšenému počtu trombocytů. Pseudotrombocytóza odezní po odstranění abnormálních erytrocytů z oběhu.

2.4Aglutinace erytrocytů

Aglutinací erytrocytů rozumíme jejich shlukování, které může být zapříčiněno přítomností protilátek. Zralé erytrocyty aglutinují, pokud jsou potaženy protilátkami.

Může se jednat o protilátky:

•chladové (nejčastěji),

•tepelné.

Při analýze takového vzorku krve na analyzátoru krvinek dochází k snížení počtu erytrocytů, a naopak k zvýšení parametru MCHC a MCH, hodnota hematokritu je nižší a neodpovídá hodnotě hemoglobinu.

Tento jev je možné eliminovat zahřátím vzorku na teplotu 37 °C (obr. 2.4). Současné moderní analyzátory krvinek k tomu využívají speciální softwarovou aplikaci. Krevní nátěr pro mikroskopické hodnocení se provádí na nahřátém podložním skle.

Musíme od sebe odlišit dva jevy:

•aglutinaci erytrocytů (způsobenou přítomností protilátek), přítomnou např. u dg. autoimunitní hemolytické anemie (AIHA), paroxyzmální chladové hemoglobinurie, potransfuzní inkompatibility,

•penízkovatění erytrocytů – rouleaux (způsobené přítomností monoklonálního imunoglobulinu – paraproteinu). Jde o slepování erytrocytů s tvorbou řetízků.

Obrázek 2.4 Aglutinace erytrocytů

Hodnoty krevního obrazu u pacienta s aglutinací erytrocytů, kdy vzorek jeho krve byl nejprve měřen při laboratorní teplotě, a poté po zahřátí na teplotu 37 °C, včetně mikroskopického hodnocení nátěru (přítomnost a nepřítomnost aglutinace erytrocytů).

Obrázek 2.5 Aglutinace neutrofilů

Rouleaux se vyskytuje v krevním nátěru např. u pacientů s rozvinutou formou mnohočetného myelomu a Waldenströmovy makroglobulinemie.

2.5Aglutinace neutrofilů

Velmi vzácně se může objevit i aglutinace (shlukování) neutrofilů (obr. 2.5). Je možné ji eliminovat zahřátím vzorku na 37 °C.

2.6Jiné možné příčiny falešných výsledků krevního obrazu

Příčinou falešných výsledků KO mohou být i problémy spojené s exspirovanými zkumavkami, problémy související s technicky nesprávně provedeným odběrem (např. nesprávně odebrané množství krve, sražená krev, krev naředěná infuzí nebo ovlivněná transfuzními přípravky) či překročení doby stability vzorku krve. Jde o chyby v tzv. preanalytické fázi analytického procesu, které představují až 70 % všech laboratorních chyb.

2.6.1Exspirované zkumavky

Vyšetření KO se provádí z nesrážlivé krve. Periferní krev pacienta se odebere do zkumavky s protisrážlivým činidlem, kterým jsou soli kyseliny etylendiaminotetraoctové (K3EDTA, popř. K2EDTA). EDTA vyvazuje vápník, tím se krev stává nesrážlivou. Soli EDTA jsou rozmístěny po stěnách zkumavky v lyofilizované podobě.

Poměr EDTA/krev se udává jako:

1,5 ± 0,3 mg EDTA / 1 ml krve

Je-li zkumavka exspirovaná, dochází ke změně poměru EDTA/krev a v krvi pacienta se mohou vyskytnout sraženiny. Ve výsledku KO dochází k poklesu hodnot (nejčastěji hemoglobinu a počtu trombocytů).

2.6.2Nesprávně odebrané množství krve pacienta

Správně odebrané množství krve je po rysku vyznačenou na zkumavce (standardně jsou to 2–3 ml, toleruje se odchylka ±10 %).

Při odebraném množství krve pod rysku dochází ke změně poměru EDTA/krev ve zkumavce. Je zde více protisrážlivého činidla, což ovlivní výsledek KO (snížení hematokritu, zvýšení střední koncentrace hemoglobinu, fragmentace trombocytů, artefakty morfologie buněk).

Při odebraném množství krve nad rysku také dochází ke změně poměru EDTA/krev ve zkumavce. Je zde méně protisrážlivého činidla v krvi pacienta se mohou vyskytnout sraženiny, které ovlivní výsledek KO (nejčastěji snížení hodnot hemoglobinu a počtu trombocytů).

2.6.3Sražená krev

Ke vzniku sraženiny může dojít:

•již při odběru krve pacienta (nesprávná technika odběru – traumatický odběr), přičemž je aktivována koagulační kaskáda,

•při odebraném množství krve nad rysku vyznačenou na zkumavce,

•kvůli zkumavce s prošlou exspirační lhůtou.

Sražená krev vždy ovlivní výsledek KO (nejčastěji snížení hodnot hemoglobinu a počtu trombocytů). Takový výsledek není validní a vždy je nutné provést nový odběr krve pacienta.

2.6.4Krev naředěná infuzí (nebo ovlivněná transfuzí)

Krev je odebraná z místa, do kterého je zavedena infuze (často jde o centrální žilní kanylu, port s připojenou prodlužovací hadičkou). Dochází k naředění vzorku krve, což ovlivní výsledek KO (snížení hodnot). Takový výsledek není validní a vždy je nutné provést nový odběr krve.

Hodnoty KO mohou obdobným způsobem ovlivnit aplikované transfuzní přípravky.

2.6.5Stabilita vzorku krve

Podstatnou roli hraje i čas, který uplyne od odběru vzorku do jeho zpracování. Stabilita vzorku krve pro vyšetření KO je 5 hodin od odběru. Po překročení doby stability dochází ke změnám metabolismu krevních buněk, které se začnou rozpadat. Tyto změny se pak mohou negativně promítnout do výsledku vyšetření.

Vzorky, které jsou obtížněji hodnotitelné, vyžadují od pracovníků laboratoře dobrou znalost práce s analyzátory krvinek. Správné vyhodnocení informací, které analyzátory poskytují, vede k vydání validních výsledků.

3Jak správně mikroskopovat

Jarmila Juráňová

V hematologické diagnostice používáme k rutinnímu hodnocení mikroskopických preparátů světelný mikroskop se suchým objektivem (10násobné až 100násobné zvětšení) a většinou také s imerzním objektivem (50násobné až 100násobné zvětšení s použitím imerzního oleje). Mikroskopickým preparátem je správně připravený a speciálně (panopticky) obarvený nátěr. Jedná se buď o nátěr periferní krve, nebo o nátěr aspirátu kostní dřeně, příp. otisk uzliny.

Nátěr periferní krve provádí zdravotní laborant z kapky nesrážlivé krve (periferní krev je odebraná do protisrážlivého činidla K3EDTA), případně ze srážlivé (kapilární) krve, pomocí roztíracího sklíčka na podložním skle. Nátěr by neměl být příliš silný, ale rovnoměrně rozetřený, na jeho konci „doztracena“, nesmí sahat až k okrajům podložního sklíčka, ani k jeho koncům.

Nátěr aspirátu kostní dřeně provádí lékař ihned po aspiraci kostní dřeně pacienta (speciální punkční či bioptickou jehlou). Biologický materiál (nejlépe z první porce aspirátu) je aplikován na podložní sklíčko a rozetřen pomocí roztíracího sklíčka stejným způsobem jako v případě zhotovení nátěru periferní krve.

Nátěr se vždy nechá řádně zaschnout. Podrobnější hodnocení je možné až po speciálním (panoptickém) obarvení krevního nátěru (viz kapitola 4).

3.1Postup při hodnocení manuálního diferenciálního rozpočtu

Hodnocení začíná přehledným zhodnocením nátěru periferní krve suchým objektivem při malém zvětšení (ideálně 200×, nejvýše do 400×*1), kdy hodnotíme:

•buněčnost, kvalitu a obarvení nátěru,

•rozložení buněk – tzn. jak přítomnost buněk v koncích a okrajích nátěru (zde mohou být vytlačeny velké a patologické buňky), tak v hustých místech (zde se mohou nacházet mikrosraženiny trombocytů, které v místě s nízkou buněčností nemusíme najít).

Toto malé zvětšení nám pomůže vytipovat optimální místo k provedení rozpočtu leukocytů i hodnocení morfologie všech buněčných elementů.

Poté následuje hodnocení buněčných krevních elementů včetně stanovení jejich početního zastoupení. To lze provést při větším zvětšení 500–1 000×*. Pro zhotovení diferenciálního počtu leukocytů a pro detailní hodnocení morfologie jednotlivých buněk je obvykle doporučováno velké zvětšení 1 000×* (suchým nebo imerzním objektivem). K hodnocení si vybíráme „optimální místo“, kde jsou buňky rovnoměrně rozprostřeny (erytrocyty se nepřekrývají). Nejčastěji se jedná o místo asi 1 cm od konce nátěru (obr. 3.1). Nátěr v mikroskopu hodnotíme meandrovitým rovnoměrným pohybem objektivu po podložním skle – nejlépe na šířku skla od jednoho okraje k druhému (obr. 3.1).

Obrázek 3.1 Hodnocení nátěru periferní krve (šipka ukazuje směr rozetření, dále je naznačen meandrovitý pohyb objektivu po podložním skle)

Rozpočet leukocytů se provádí s pomocí hematologického sumátoru obvykle na 100 nalezených buněk.

Hodnocení obarvených nátěrů periferní krve (tzn. provedení diferenciálního počtu leukocytů) lze také stanovit automaticky (jak už bylo zmíněno v kapitole 1.4.) pomocí analyzátoru pro digitální morfologii buněk. Přístroj provede diferenciální počet leukocytů a morfologické hodnocení změn leukocytů, erytrocytů a trombocytů včetně jejich patologií. Kontrola a potvrzení výsledku však nadále zůstává na laboratorním pracovníkovi. Využití digitální morfologie v hematologické laboratoři se stává rutinní metodou zhodnocení nátěru periferní krve.

3.2Hodnocení nátěru periferní krve

3.2.1Hodnocení kvantitativní – na 100 leukocytů

a)diferenciální počet leukocytů,

b)počet erytroblastů (normoblastů).

3.2.2Hodnocení relativního počtu – na 1 000 erytrocytů

a)počet schistocytů,

b)počet trombocytů,

c)počet akantocytů.

3.2.3Hodnocení morfologických změn (včetně jejich semikvantitativního, případně i kvantitativního hodnocení)

a)erytrocytů,

b)leukocytů,

c)trombocytů.

Při morfologickém hodnocení leukocytů, erytrocytů a trombocytů hodnotíme nález slovně, sílu pozitivity hodnotíme na 1–3 křížky.

Fyziologické hodnoty (relativní počet) pro manuální diferenciální počet leukocytů u dospělých jsou uvedeny v tabulce 3.1.

Tabulka 3.1 Fyziologické hodnoty manuálního diferenciálního počtu leukocytů v periferní krvi dospělých (pro muže a ženy nad 15 let)

Název

Referenční meze

Jednotka

Neutrofilní segmenty

47–70

%

Neutrofilní tyče

0–4

%

Neutrofilní metamyelocyty

0–0

%

Neutrofilní myelocyty

0–0

%

Promyelocyty

0–0

%

Myeloblasty

0–0

%

Lymfocyty

20–45

%

Monocyty

2–10

%

Eozinofily

0–5

%

Bazofily

0–1

%

Erytroblasty

0–0

%

3.2.4Patologické hodnoty

Kvantitativní – snížené nebo zvýšené počty (absolutní nebo relativní) jednotlivých populací leukocytů, posun doleva, přítomnost metamyelocytů, myelocytů a promyelocytů (leukemoidní reakce, myeloproliferativní onemocnění…), přítomnost blastů (akutní leukemie, myelodysplastický syndrom, myeloproliferativní onemocnění…), přítomnost erytroblastů (hemolytické anemie, myelofibróza, infiltrativní proces v kostní dřeni, např. nádorové metastázy…), tzv. leukoerytroblastický obraz (myelofibróza, infiltrativní proces v kostní dřeni, např. nádorové metastázy…).

Kvalitativní – např. toxická granulace, nebo naopak hypogranularita, zvýšená či snížená segmentace jader neutrofilů, výrazné morfologické změny erytrocytů (anemie…), nález parazitů (např. u malárie a leishmaniózy), změny morfologie monocytů a lymfocytů, nález atypických lymfoidních elementů (reaktivní změny např. při virových infekcích, lymfoproliferativní choroby…) atd.

3.3Postup při hodnocení myelogramu (aspirátu kostní dřeně)

Vlastní hodnocení začíná přehledným zhodnocením nátěru kostní dřeně suchým objektivem při malém zvětšení (ideálně 200×*), kdy hodnotíme:

•buněčnost (celularitu), kvalitu a obarvení nátěru,

•rozložení buněk (tzn. přítomnost buněk v koncích a okrajích nátěru, ale i v hustých oblastech nátěru, zejména u ložiskových procesů),

•zastoupení megakaryocytů,

•přítomnost a buněčnost stromatu.

Toto malé zvětšení nám pomůže najít optimální místo k diferencování i hodnocení morfologie všech buněčných elementů.

Poté následuje hodnocení jaderných buněk včetně stanovení jejich početního zastoupení. To lze provést při větším zvětšení 600–1 000×*. Detailní hodnocení morfologie jednotlivých buněk a diferenciální počet elementů kostní dřeně se obvykle doporučuje provést při velkém zvětšení 1 000×*2(suchým nebo imerzním objektivem). K hodnocení si vybíráme „optimální místo“, kde jsou buňky rovnoměrně rozprostřeny, pokud možno ne až v koncové části nátěru, kde jsou buňky arteficiálně zvětšeny. Volba vhodné části nátěru souvisí s buněčností aspirátu kostní dřeně. Nalezené jaderné buňky se počítají pomocí hematologického sumátoru obvykle na 500 buněk.

V poslední době je evidentní snaha využít při hodnocení aspirátu kostní dřeně umělou inteligenci. První systémy, které jsou již komerčně dostupné, dokáží velmi rychle naskenovat nátěry a určit některé typy buněk. Problémem stále zůstává hodnocení atypických a patologických buněk. Laborant a posléze lékař musí v druhé fázi hodnocení tento nález verifikovat, opravit. Lze předpokládat, že tyto přístroje se v blízké budoucnosti rozšíří do rutinní praxe.

3.4Hodnocení nátěru aspirátu kostní dřeně

3.4.1Hodnocení kvalitativní

a)orientační hodnocení buněčnosti nátěru, kvality nátěru a barvení,

b)orientační hodnocení zastoupení megakaryocytů,

c)prohlédnutí okrajových částí nátěru,

d)vyhledání makroskopicky viditelných fragmentů kostní dřeně a posouzení jejich buněčného složení.

3.4.2Hodnocení kvantitativní

a)diferenciální počet jaderných buněk.

3.4.3Hodnocení a popis morfologických změn

a)erytropoezy,

b)granulopoezy a lymfopoezy,

c)trombocytopoezy,

d)hodnocení dalších nalezených elementů.

3.4.4Patologické hodnoty

Kvantitativní nebo kvalitativní změny v kostní dřeni mohou být typické pro určité hematologické onemocnění či pro celou skupinu onemocnění.

3.4.5Základní charakteristiky nálezů u vybraných onemocnění

Dřeňové útlumy: snížená buněčnost, relativní lymfocytóza, relativně zvýšené zastoupení buněk stromatu (makrofágy, retikulární buňky)…

Akutní leukemie: populace blastických elementů nad 20 % (dle WHO).

Tabulka 3.2 Fyziologické hodnoty (relativní počet) pro myelogram (aspirát kostní dřeně) u dospělých (pro muže a ženy nad 15 let)

Název

Referenční meze

Jednotka

Granulocytární řada

granulocytární řada (součet)

52–70

%

neutrofilní řada (součet)

50–70

%

myeloblasty

0–3

%

promyelocyty

1–5

%

neutrofilní myelocyty

5–25

%

neutrofilní metamyelocyty

5–25

%

neutrofilní tyče

10–30

%

neutrofilní segmenty

7–25

%

eozinofilní řada (součet)

0–6

%

eozinofilní myelocyty

0–2

%

eozinofilní metamyelocyty

0–2

%

eozinofilní tyče

0–2,4

%

eozinofilní segmenty

0,2–3

%

bazofilní řada (součet)

0–2

%

bazofilní myelocyty

0–0,5

%

bazofilní segmenty

0–1

%

Červená řada

červená řada (součet)

15–27

%

proerytroblasty

0–2

%

erytroblasty bazofilní

1–3

%

erytroblasty polychromní

2–20

%

erytroblasty ortochromní

2–15

%

Poměr granulocytární a červené řady

G/E poměr

2–4/1

ratio

Megakaryocytární řada

megakaryocyty

0–1

%

Mononukleáry

lymfocyty

4–20

%

monocyty

0–2

%

plazmocyty

0–4

%

retikulární buňky

0–2

%

Myelodysplastický syndrom (MDS): může být zvýšené zastoupení blastů až do 20 %, většinou zvýšená buněčnost, morfologické změny v krevních řadách (dysplazie)…

Mnohočetný myelom: většinou zvýšené zastoupení plazmatických buněk, abnormální plazmatické buňky, rouleaux erytrocytů v nátěru periferní krve…

Megaloblastové anemie: megaloblastická přestavba erytropoezy, další změny ve všech krevních řadách, nález obřích tyčí a metamyelocytů, hypersegmentace neutrofilů, popř. abnormality megakaryocytů.

Hemolytické anemie: kompenzační hyperplazie erytropoezy (zvýšeně zastoupená, se zvýšenou mitotickou aktivitou), mohou být přítomny i určité známky dyserytropoezy, nález velkých „hnízd“ erytroblastů…

Chronická myeloidní leukemie (CML): zvýšená buněčnost, výrazná převaha granulocytární řady, posun k nezralým formám, eozinofilie, bazofilie…

Chronická lymfatická leukemie (CLL): výrazné zvýšené zastoupení většinou atypických lymfocytů, jaderné stíny (tzv. Gumprechtovy stíny – více patrné v nátěru periferní krve)…

Vlasatobuněčná leukemie (HCL – hairy cell leukemie): snížená buněčnost, nález atypických „vlasatých“ lymfoidních elementů.

Maligní lymfomy: možný nález atypických lymfoidních elementů při postižení kostní dřeně lymfomem.

Metastázy do kostní dřeně: nález nehematopoetických buněk volně, ale zejména v kohezivních shlucích (mikrometastázy), nátěry aspirátu kostní dřeně mohou být spíše hypocelulární, v nátěru periferní krve může být leukoerytroblastický obraz (vyplavování méně zralých elementů granulopoezy a erytroblastů), případně dakryocyty.

Fibróza kostní dřeně: leukoerytroblastický obraz v nátěru krve, dakryocyty, poikilocytóza…

1* Příslušná zvětšení vznikla vynásobením zvětšení objektivu zvětšením okuláru (tj. 10×).

2* Příslušná zvětšení vznikla vynásobením zvětšení objektivu zvětšením okuláru (tj. 10×).

4Barvení mikroskopických preparátů používaná v hematologii

Jarmila Juráňová

Hodnocení mikroskopických preparátů je možné až po jejich obarvení, které umožní odlišení jednotlivých druhů buněčných krevních elementů v mikroskopu. V hematologii se používají různá speciální barvení.

Mezi základní a nejčastěji používaná patří tzv. Pappenheimova panoptická barvicí metoda. Krevní nátěry se fixují metanolem a následně barví Mayovým–Grünwaldovým roztokem (obsahuje barvivo eozin) a dobarvují se roztokem Giemsy–Romanowského (obsahuje barvivo azur). Některé laboratoře fixaci metanolem nepoužívají, neboť barvení Mayovým–Grünwaldovým roztokem současně preparát fixuje.

Základem této barvicí metody jsou dvě barviva:

•anionické (kyselé) barvivo eozin Y, které se váže na kationické části proteinů a dává oranžovočervené zbarvení hemoglobinu a eozinofilním granulím,

•kationické (zásadité) barvivo azur B, které se váže na anionické části a dává modrošedé zbarvení nukleovým kyselinám (DNA nebo RNA), nukleoproteinům, granulím bazofilů a jemným granulím v neutrofilech.

Při barvení vznikají různé kombinace těchto dvou základních barev.

4.1Hodnocení krevních nátěrů obarvených panopticky

Dobře obarvený krevní nátěr má na pohled světle růžovofialovou barvu. Při hodnocení v mikroskopu mají:

•erytrocyty růžovou barvu,

•trombocyty světle modrou cytoplazmu a tmavě růžová granula,

•neutrofily světle růžovou cytoplazmu, růžová až červenohnědá granula a fialovočervené jádro,

•eozinofily cihlově červená až oranžovohnědá granula (dobrý ukazatel správnosti barvení),

•bazofily fialovočervená granula,

•lymfocyty bleděmodrou průhlednou cytoplazmu,

•monocyty šedomodrou cytoplazmu (ta může obsahovat azurofilní granula).

4.2Zdroje chyb při obarvení nátěru periferní krve či kostní dřeně

•Nadměrně obarvené nátěry jsou modrofialové, málo obarvené jsou červenorůžové (nedodržená doba barvení barvicím roztokem). Přebarvené nátěry můžeme odbarvit oplachováním pod tekoucí vodou. Staré krevní nátěry bývají často přebarvené.

•Obarvený nátěr má růžovou barvu, erytrocyty mají příliš červený odstín, eozinofilní granula jsou světle červená (kyselé pH destilované vody).

•Obarvený nátěr má modrošedou barvu, erytrocyty mají modrošedý odstín, eozinofilní granula jsou modrošedá (zásadité pH destilované vody).

•Obarvený nátěr se z podložního sklíčka při oplachování destilovanou vodou sloupl (nátěr nebyl dostatečně zaschlý a zafixovaný).

•Nátěr je nerovnoměrně obarvený (nátěr nebyl dostatečně opláchnutý vodou a zůstaly na něm barevné skvrny).

•Pozor na kontaminaci vlhkostí v roztocích a na nátěru (již 1% kontaminace metanolu vodou může znemožnit správnou interpretaci vyšetření, zvláště morfologii erytrocytů).

Kromě Pappenheimovy panoptické barvicí metody používané především v Evropě existují ještě další modifikace polychromatického barvení krevních buněk, zejména Wrightova metoda (používaná v USA).

4.3Mikroskopické stanovení retikulocytů

Retikulocyty (mladé červené krvinky) lze prokázat mikroskopem v nátěru nativní periferní krve po obarvení supravitálními barvivy (např. brilantkresylovou modří). V takto obarveném žlutozeleném erytrocytu nacházíme modře zbarvená vlákénka nebo zrnka. Spleť vláken a zrnek v retikulocytu se nazývá substancia reticulofilamentosa. Je to umělý útvar, který vzniká shluknutím zbytků endoplazmatického retikula a Paladeho zrn s mitochondriemi účinkem barviva. Podle množství zrn a sítě vláken lze rozlišit více či méně zralé retikulocyty. V panoptickém barvení retikulocytům odpovídají polychromaticky se barvící, převážně větší erytrocyty.

Ke znázornění struktur a součástí krvinek, které při panoptickém barvení nejsou rozpoznatelné, lze použít speciální cytochemické barvicí metody. Ty slouží ke zjištění přítomnosti zásobního železa v cytoplazmě buněk červené řady a v makrofázích kostní dřeně. Dále slouží ke znázornění zejména lipidů, bílkovin, cukrů a enzymů v bílých krvinkách. Barvení nám pomáhá sledovat metabolismus buňky (např. u železa), hodnotit nedostatek určitého enzymu (např. alkalické fosfatázy), přispívá ke klasifikaci leukemií (např. sledování nezralých buněk u akutních myeloidních leukemií, abnormalit ve vyzrávání u MDS a myeloproliferativních stavů).

Cytochemické barvicí metody obsahují tři základní kroky: fixaci, vlastní cytochemickou reakci a dobarvování jader. Při některých cytochemických reakcích prokazujeme enzymy pomocí tzv. blokády. Některé enzymy mají v různých buňkách stejnou funkci, ale odlišnou strukturu, což umožňuje specifické vazby přidaných blokujících látek (fluoridu sodného nebo kyseliny vinné) na tyto enzymy.

Cytochemické barvicí metody hodnotíme podle typu pozitivity (difuzní, granulární, bloková, fokální). Intenzitu pozitivity hodnotíme na 1–3 křížky, nebo určujeme stupně pozitivity (tzv. skórování). Mezi speciální cytochemické barvicí metody patří:

4.4Průkaz železa (Perlsova reakce)

V cytoplazmě erytroblastů, erytrocytů a makrofágů se mohou nacházet zrnka zásobního železa. Ta představují železo, které se ještě nezabudovalo do hemoglobinu. Při barvení na železo nám erytroblasty, erytrocyty a makrofágy, které obsahují železo ve formě zrnek, dávají pozitivní Perlsovu reakci a označují se jako sideroblasty, siderocyty a siderofágy.

Ferokyanid draselný v kyselém prostředí (kyselina chlorovodíková) reaguje s Fe3+ (zásobní železo) a vytváří modré zbarvení, tzv. berlínskou (pruskou) modř Fe4[Fe(CN)6]3.

Nehemové železo je takto viditelné prostřednictvím modrozelených zrnek v cytoplazmě buněk nebo v extracelulárních prostorách. Zásobní železo bývá přítomno také v monocytomakrofágovém systému. Všechno železo přítomné v cytoplazmě erytroblastů je normálně využíváno pro tvorbu hemoglobinu. Jestliže je jakkoli syntéza hemoglobinu narušena, zůstává železo v erytroblastech i v erytrocytech ve větších zrnkách nebo v jejich větším počtu.

U sideropenické anemie (anemie z nedostatku železa) je množství železa v erytroblastech výrazně sníženo nebo je železo nepřítomno (snížený počet, případně sideroblasty úplně chybí).

Zvýšený počet sideroblastů bývá u MDS, leukemií, hemolytické a megaloblastové anemie, po častých transfuzích, po splenektomii, u alkoholismu.

U sideroblastické anemie a některých typů MDS se vyskytuje ve větší míře v cytoplazmě erytrocytů i erytroblastů siderotická granulace. Objevuje-li se siderotická granulace okolo jádra erytroblastů v podobě kroužku, nazýváme tyto sideroblasty jako prstenčité sideroblasty.

Siderotická granula se hodnotí běžně v kostní dřeni ve 100 erytroblastech s normálními hodnotami 20–80 % sideroblastů. Při hodnocení si všímáme počtu a velikosti granulí v sideroblastech a počtu prstenčitých sideroblastů. Prstenčité sideroblasty se v kostní dřeni zdravých lidí nevyskytují. Dále si všímáme přítomnosti siderocytů, zásobního železa v makrofázích (siderofázích) a extracelulárního zásobního železa.

Význam níže uváděných speciálních barvení je v poslední době oslaben dostupností více specifických a senzitivnějších vyšetření, jakými jsou metody molekulární genetiky nebo imunofenotypizace.

Při diagnostice akutních leukemií a myelodysplastických neoplazií se používají následující cytochemická barvení:

4.5Průkaz myeloperoxidázy (peroxidázová reakce, MPOX, POX)

Peroxidázy jsou enzymy, které se používají k průkazu buněk granulocytární řady. POX je lysozomální enzym přítomný v primárních (azurofilních) granulích neutrofilů a monocytů. Peroxidázy obsažené v granulocytech katalyzují reakci, při které se z peroxidu vodíku uvolní kyslík. Kyslík oxiduje dodaný substrát (většinou diaminobenzidin) na barevný produkt. Hodnotíme pozitivitu (okrové zbarvení) ve 100 blastických buňkách. Pokud ve vyšetřovaném vzorku najdeme nejméně 3 % POX pozitivních blastických buněk, můžeme blastické buňky zařadit do myeloidní linie (jedná se tedy o myeloidní leukemii). Množství POX v myeloidních buňkách se zvyšuje postupně s vyzráváním buněk (v monocytech bývá jemná granulární pozitivita). Sílu pozitivity hodnotíme na 1–3 křížky. Průkaz POX nám pomáhá rozlišit myeloblastickou nebo monoblastickou leukemii od lymfoblastické.

4.6PAS reakce (Periodic Acid-Schiff, reakce kyseliny jodisté se Schiffovým činidlem) – průkaz glykogenu

Glykogen je jediný zdroj energie pro metabolismus leukocytů. PAS reakce tak slouží k cytochemickému průkazu glykogenu v krevních buňkách. Působením kyseliny jodisté dochází k oxidaci hydroxylových skupin polysacharidů za vzniku dialdehydu. Aldehydy reagují se Schiffovým činidlem a vzniká růžovočervená sloučenina. Hodnotíme pozitivitu (růžovočervené zbarvení) ve 100 blastických buňkách. Při hodnocení rozlišujeme negativní a pozitivní elementy. Důležité je odlišit difuzní pozitivitu od granulární až po blokovou pozitivitu. Intenzitu pozitivity hodnotíme na 1–3 křížky s popisem typu pozitivity (difuzní / granulární / bloková). PAS reakci vykazují některé typy lymfoblastů. Hodnocení PAS reakce má význam pro diagnostiku dětských akutních lymfoblastických leukemií, které vycházejí z prekurzorů B-lymfoidních elementů. U erytroleukemií (AL-M6 dle FAB klasifikace) či MDS můžeme pozorovat difuzní či granulární PAS pozitivitu v erytroblastech.

4.7Barvení Sudanovou černí B – průkaz lipidů

Buněčné struktury, které obsahují tuky, váží Sudanovou čerň B. Sudanofilní lipidy jsou obsažené v primárních granulích mladších forem buněk granulocytární řady. Hodnotíme 100 blastických buněk. Sílu pozitivity můžeme hodnotit na 1–3 křížky. Průkaz Sudanu nám pomáhá rozlišit myeloblastickou nebo monoblastickou leukemii od lymfoblastické. Myeloidní elementy vykazují pozitivní reakci, intenzita zbarvení stoupá s vyzráváním buněk. Monocyty mají slabší granulární pozitivitu.

4.8Průkaz naftol AS-D chloracetát esterázy

Esterázy jsou lysozomální enzymy, které jsou spojovány s azurofilními (primárními) granuly. Granulocyty a monocyty obsahují ve svých granulích esterázy.

Specifická esteráza (naftol AS-D chloracetát esteráza) je enzym nacházející se v elementech neutrofilní granulopoezy. Uvolňuje ze substrátu naftol, který reaguje s hexazotizovaným novým fuchsinem za vzniku nerozpustné červenavé sloučeniny. Hodnotíme 100 blastických buněk. Pozitivitu (červenavé zbarvení) hodnotíme na 1–3 křížky.

Toto barvení se používá při diagnostice myeloidních leukemií. Zralejší buňky myeloidní řady vykazují jasnou pozitivitu, monocyty bývají jen velmi slabě pozitivní, ostatní buňky jsou negativní. V případě nálezu abnormálních eozinofilů (AML-M4EO podle klasifikace FAB) můžeme pozorovat výraznou aberantní pozitivitu eozinofilních elementů.

4.9Průkaz nespecifických esteráz s blokádou fluoridem sodným (ANAE + NaF, α-naftylacetát esteráza s blokádou fluoridem sodným)

Nespecifické esterázy (α-naftylacetát esteráza) hydrolyzují α-naftylacetát za uvolnění naftylu, který se váže s pararosanilinem, za vzniku rezavě hnědé nerozpustné sloučeniny. K reakci dochází v místech přítomnosti enzymu a v určitých buňkách může být reakce inhibována fluoridem sodným (NaF). Hodnotíme 100 blastických buněk. Pozitivitu (rezavě hnědé zbarvení) můžeme hodnotit na 1–3 křížky.

Toto barvení se používá k rozlišení myeloidní a monocytární leukemie. Nespecifické esterázové barvení je výrazně pozitivní pro monocytoidní elementy. V těchto buňkách reakci inhibuje NaF, pozitivita je potom snížená nebo nulová. U myeloidní leukemie je reakce jen slabě pozitivní nebo negativní a nedochází ke změně síly pozitivity v přítomnosti NaF (k blokádě fluoridem sodným). U myelomonocytární leukemie pozorujeme jasnou pozitivitu u monocytů, blokovanou v přítomnosti NaF, a negativitu nebo slabou pozitivitu myeloidních buněk bez blokády. V případě lymfoblastických leukemií můžeme pozorovat slabě pozitivní reakci blastických elementů bez blokády NaF.

4.10Průkaz alkalické fosfatázy leukocytů

Alkalická fosfatáza (AF) je enzym obsažený v sekundárních (specifických) granulích neutrofilních segmentů a tyčí, někdy nacházíme velmi slabou pozitivitu i v B-lymfocytech.

Leukocytární alkalická fosfatáza odštěpí ze substrátu volný α-naftol, který s diazoniovou solí vytvoří nerozpustnou sraženinu (barevnou sloučeninu), lokalizovanou intracelulárně. Reakce je pozitivní jen ve zralých neutrofilních leukocytech se segmentovaným jádrem, a to ve formě rezavě hnědých až hnědočerných zrn.

Množství AF se mění při různých onemocněních a pomáhá odlišit leukemoidní reakci – např. při zánětlivém onemocnění (AF je zvýšená) od chronické myeloidní leukemie (AF je nápadně snížená).

Zvýšená hodnota AF bývá v těhotenství, při infekcích, při užívání kortikosteroidů, při stresu, intoxikaci, uremii. V hematologii při pravé polycytemii a primární myelofibróze, MDS, mnohočetném myelomu, při relapsu akutní leukemie.

Snížená hodnota AF bývá u CML (chronické myeloidní leukemie), paroxyzmální noční hemoglobinurie, hereditární sférocytóze a sideroblastické anemii.

4.11Průkaz kyselé fosfatázy s rezistencí na kyselinu L-vinnou (TRAP – tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza, kyselá fosfatáza rezistentní k přítomnosti kyseliny vinné)

Kyselé fosfatázy jsou enzymy nacházející se v lysozomech řady hemopoetických buněk.

Kyselá fosfatáza (KF) odštěpuje ze substrátu nerozpustný α-naftol, který vytváří s diazoniovou solí (např. Fast Garnet GBC) červeně zbarvené precipitáty. Za přítomnosti kyseliny L-vinné (vinanu sodného – tartrátu) je aktivita kyselé fosfatázy většinou inhibována. Hodnotíme 100 lymfoidních elementů. Pozitivitu (červené zbarvení) můžeme hodnotit na 1–3 křížky.

Barvení kyselé fosfatázy pomáhá při diagnostice vlasatobuněčné leukemie (hairy cell leukemie). Elementy vlasatobuněčné leukemie vykazují výraznou difuzní a granulární pozitivitu KF. Za přítomnosti kyseliny vinné je aktivita kyselé fosfatázy v lymfocytech, které nejsou „vlasaté“, většinou inhibována. Avšak u buněk vlasatobuněčné leukemie je kyselá fosfatáza vůči kyselině vinné rezistentní. Pokud pozitivita KF v lymfocytech setrvává i v přítomnosti kyseliny vinné, může se jednat o elementy vlasatobuněčné leukemie (viz kapitola 20.2).

5Popis jednotlivých druhů normálních buněk vperiferní krvi akostní dřeni

Jarmila Juráňová, Edgar Faber

5.1Hemopoeza

Krvetvorba (neboli produkce krevních buněk) zahrnuje jak proliferaci buněk vhemopoetických orgánech, tak jejich vyzrávání adodávání funkčně zralých krevních buněk do periferní krve.

Vývoj krevních buněk probíhá vkostní dřeni od kmenových buněk přes buňky progenitorové až po velmi diferencované buňky, jakými jsou:

•erytrocyty (účastní se transportu kyslíku),

•leukocyty (účastní se obranyschopnosti organismu),

•trombocyty (účastní se procesů srážení krve).

Hemopoeza probíhá podle schématu uvedeného na obrázku 5.1.

Krvetvorba probíhá vkostní dřeni takovým způsobem, že zjednotlivých mateřských buněk vznikají proliferací (dělením), diferenciací (odlišením) amaturací (zráním) nové krvetvorné buňky, které se od původní mateřské buňky liší morfologicky, funkčně istrukturálně.

Krvinky vznikají zkmenových amateřských (progenitorových) buněk dělením– mitózou. Buňky, jež nejsou schopny mitózy, už jen vyzrávají.

Všechny krvinky vperiferní krvi člověka mají (po narození ivdospělosti) jednu jedinou společnou hemopoetickou, tzv. pluripotentní, kmenovou buňku, která se vrámci hemopoezy může vyvíjet jakýmkoliv směrem, tzn. vmateřské buňky erytrocytů, leukocytů, trombocytů.

5.2Pluripotentní kmenové buňky

•jsou mononukleární buňky,

•velikosti 7–10 μm,

•mají jemně rozptýlený chromatin,

•vjejich jádru jsou viditelná 1–3 jadérka,

•na jejich povrchu je navázaná řada antigenů, znichž některé chybí na diferencovaných progenitorových buňkách,

•mají schopnost sebeobnovy,

•mohou se dále dělit (část se podle potřeby diferencuje vprogenitorové kmenové buňky), jejich větší část se nedělí, tvoří tzv. rezervní pool (obr. 5.2).

Obrázek 5.1 Schéma základního principu hemopoezy

Obrázek 5.2 Dělení pluripotentní kmenové buňky

Při mitóze se většinou jedna dceřiná buňka diferencuje dále, zatímco druhá zůstává pluripotentní kmenovou buňkou.

5.3Progenitorové kmenové buňky

•jsou schopny diferenciace do jedné či více krevních řad,

•většina je již vbuněčném cyklu,

•nemají schopnost sebeobnovy,

•jsou citlivé na růstové faktory,

•značíme je CFU (colony forming unit).

Progenitorové kmenové buňky jsou již určeny pro jednu nebo více krevních řad, např.:

•CFU-E (erytrocyte) aBFU-E (burst forming unit-erythroid) pro červenou řadu,

•CFU-GEMM (granulocyte, erytrocyte, macrophage, megakaryocyte) pro buňky myelopoezy,

•CFU-GM (granulocyte, macrophage) pro granulocytární amakrofágovou řadu,

•CFU-N (neutrophile) pro neutrofilní řadu,

•CFU-Eos (eosinophile) pro eozinofilní řadu,

•CFU-Baso (basophile) pro bazofilní řadu,

•CFU-M (macrophage) pro monocytární řadu,

•CFU-Meg (megakaryocyte) pro megakaryocytární řadu.

Poznámka: BFU-E jsou primitivní progenitorové buňky pro červenou řadu. CFU-E jsou zralé progenitorové buňky pro červenou řadu.

Hemopoezu rozdělujeme na:

•myelopoezu,

•lymfopoezu.

Základní schéma hemopoezy (obr. 5.3) ukazuje na možnosti vývoje pluripotentní kmenové buňky do různých krvetvorných linií. Jiný vývoj prodělávají buňky červené řady (erytrocyty), jiný buňky bílé řady (leukocyty) ajiný krevní destičky (trombocyty). Protože bílá složka má několik konečných stadií krvinek, není její vývojová řada jednotná.

Obrázek 5.3 Základní schéma hemopoezy

5.4Myelopoeza

Myelopoeza zahrnuje vývoj:

•části bílé řady– myeloidní buňky (granulocyty, monocyty),

•červené (erytroidní) řady,

•destičkové (megakaryocytové) řady.

Krevní elementy, jako jsou erytrocyty, granulocyty, monocyty atrombocyty, mají svůj původ vpluripotentní kmenové buňce ave vlastní mateřské (progenitorové) buňce CFU-GEMM (granulocyte, erytrocyte, macrophage, megakaryocyte).

Při diferenciaci buněk myelopoezy dochází ke změnám:

1.vcytoplazmě

•ztráta bazofilie cytoplazmy,

•vcytoplazmě granulocytů se objevují specifická granula (neutrofilní, eozinofilní abazofilní);

2.vjádře

•učervené řady je jádro vypuzeno,

•ugranulocytů se jádro zahušťuje, chromatin ztrácí jemné uspořádání atvar jádra (původně kulatý či oválný) se postupně mění na členitý.

5.4.1Bílá vývojová řada

Leukopoeza = vznik avývoj bílých krvinek.

Bílé krvinky (leukocyty) obecně dělíme:

•podle vývojové linie:

–myeloidní buňky (granulocyty, monocyty),

–lymfoidní buňky (lymfocyty, plazmocyty);

•podle obsahu granul vcytoplazmě (granularity):

–agranulocyty (monocyty, lymfocyty, plazmocyty),

–granulocyty (neutrofily, eozinofily, bazofily);

•podle členitosti jádra (lobularity):

–mononukleáry (monocyty, lymfocyty, plazmocyty),

–polynukleáry (neutrofily, eozinofily, bazofily);

•podle schopnosti fagocytózy na buňky (fagocyty):

–mikrofágy (neutrofily, eozinofily),

–makrofágy (monocyty, histiocyty);

•podle imunologického hlediska na buňky (imunocyty):

–lymfocyty (B-lymfocyty, T-lymfocyty, NK buňky),

–plazmocyty (plazmatické buňky).

Tvorba neutrofilů vkostní dřeni trvá 6 až 10 dní. Velké množství neutrofilních tyčí asegmentů (asi 10–15× vyšší počet než vperiferní krvi) tvoří vkostní dřeni tzv. rezervní pool. Další zásoby neutrofilů jsou vorganismu kdispozici vtzv. marginálním poolu– ve slezině avtěsné blízkosti stěny cév. Jejich hlavní funkcí je fagocytóza.

Přesná kinetika tvorby eozinofilů není detailně známá. Jsou také schopny fagocytózy amají důležité funkce vboji sparazity apři vzniku alergických reakcí. Podobné funkce (zejména účast včasné ipozdní hypersenzitivitě) mají také bazofily amastocyty (žírné buňky).

Monocyty po svém vzniku vkostní dřeni jsou prakticky okamžitě vyplaveny do tkání. Ve tkáních mají funkci jednak tkáňových makrofágů, ajednak buněk prezentujících antigen. Produkují řadu růstových faktorů, interleukinů, interferonů, ale také komplement aprostaglandiny. Tkáňové makrofágy lze dále podle funkce amísta působení dělit na dendritické buňky, histiocyty, retikulární buňky, stromální buňky nebo Langerhansovy buňky.

Vperiferní krvi přežívají (zůstávají):

•zralé neutrofily jen 6–12 hodin, pak přechází do tkání, kde zanikají po 2–4 dnech;

•zralé eozinofily asi 12–24 hodin, pak přechází do oblastí mimo krevní oběh;

•zralé bazofily asi 4–7 dnů;

•monocyty jen několik hodin až dní, pak přechází do tkání; některé znich se znovu vracejí do oběhu, jiné zůstávají vtkáních, kde se diferencují na specifické tkáňové makrofágy (histiocyty);

•B-lymfocyty aT-lymfocyty několik dní až týdnů, paměťové buňky několik let až desetiletí. Účastní se na specifické (B-lymfocyty aT-lymfocyty) anespecifické (NK buňky) obranyschopnosti, plazmocyty (vznikající terminální diferenciací B-lymfocytů) produkují protilátky, T-lymfocyty mají primárně regulační funkce zprostředkované přímými buněčnými kontakty aprodukcí interleukinů, interferonů adalších růstových faktorů.

Granulocytární řada

Do granulopoezy patří ty buňky kostní dřeně aperiferní krve, které dávají vznik zralým buňkám (granulocytům), tzn. segmentovaným neutrofilům, eozinofilům abazofilům.

Během vývoje granulocytů rozeznáváme stadia myeloblastů, promyelocytů, myelocytů, metamyelocytů, tyčí asegmentů. Vprůběhu vývoje se buňky morfologicky mění. Nejcharakterističtějším znakem je granulace. Rozeznáváme granulaci:

•primární (azurofilní)– jasně až tmavě červená,

•sekundární (specifická)– je trojího druhu (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní).

Neutrofilní granula– jemná, tmavě fialová až růžovofialová.

Eozinofilní granula– větší, šedooranžová až oranžově červená.

Bazofilní granula– větší, tmavě fialová až černá, překrývající většinu jádra acytoplazmy.

Myeloblast

•Kulatá nebo oválná buňka súzkým lemem bazofilní cytoplazmy.

•Průměr: 14–20 μm.

•Jádro: velké, kulaté nebo oválné, centrálně uložené, vyplňuje velkou část buňky (je bledší než jádro proerytroblastu).

•Jadérka: 2–5, jasně viditelná.

•Chromatin: jemně síťovaný, plsťovitý.

•Cytoplazma: bazofilní, bez perinukleárního projasnění, někdy houbovitá až pěnovitá, neobsahuje granula nebo obsahuje jen několik málo granul.

Promyelocyt

•Velká kulatá buňka (po megakaryocytu obvykle druhá největší buňka vkostní dřeni).

•Průměr: 18–25 μm.

•Jádro: velké, oválné, excentricky uložené (podobné jádru myeloblastu).

•Jadérka: 2–4.

•Chromatin: jemně síťovaný.

•Cytoplazma: bazofilní, obsahuje hrubá azurofilní granula, charakteristické je projasnění cytoplazmy voblasti centrozomu (Golgiho zóny).

Myelocyt (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní)

•Jde o„středně zralý“ element, poslední stadium granulopoezy, které je schopné dělení.

•Průměr: 16–20 μm.

•Jádro: kulaté či oválné, někdy lehce vtlačené, menší než upromyelocytu.

Metamyelocyt (neutrofilní, eozinofilní, bazofilní)

•Průměr: 10–18 μm.

Nesegmentovaný granulocyt– tyč (neutrofilní tyč, eozinofilní tyč, bazofilní tyč)

Segmentovaný granulocyt– segment (neutrofilní segment, eozinofilní segment, bazofilní segment)

5.4.2Červená (erytroidní) vývojová řada

Normoblastová řada

5.4.3Destičková (megakaryocytová) vývojová řada

5.4.4Monocytomakrofágová řada

Monocyt

5.5Lymfopoeza

Morfologie lymfoidních elementů