Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., MUDr. Eva Tesařová a kolektiv

HEMATOLOGIE A TRANSFUZNÍ LÉkAŘSTVÍ I
HEMATOLOGIE

Vedoucí autorského kolektivu:
Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., oddělení klinické hematologie FN Brno

Autorský kolektiv:
MUDr. Jan Blatný, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno*
RNDr. Ludmila Bourková, oddělení klinické hematologie FN Brno
MUDr. Alena Buliková, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno
Mgr. Zbyněk Čech, oddělení klinické hematologie FN Brno
Mgr. Magdaléna Jelínková, oddělení klinické hematologie FN Brno*
MUDr. Jarmila Kissová, oddělení klinické hematologie FN Brno
MUDr. Zdeněk Kořístek, Ph.D., Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Mgr. Lucie Kovářová, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno
Doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc., Ústav experimentální biologie PřF MU
MUDr. Miloslava Matýšková, CSc., oddělení klinické hematologie FN Brno
MUDr. Jan Novotný, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno
Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., oddělení klinické hematologie FN Brno
Doc. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D., Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Bc. Markéta Slánská, oddělení klinické hematologie FN Brno*
MUDr. Petr Smejkal, Ph.D., oddělení klinické hematologie FN Brno
Bc. Irena Trnavská, oddělení klinické hematologie FN Brno
MUDr. Ondřej Zapletal, oddělení klinické hematologie FN Brno*
RNDr. Jiřina Zavřelová, oddělení klinické hematologie FN Brno
* nyní oddělení dětské hematologie FN Brno

Recenze:
Doc. RNDr. Miroslav Pecka, CSc.
Prof. MUDr. Ladislav Chrobák, CSc.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

© Grada Publishing, a.s., 2011
Obrázky dodali autoři.
Cover Photo © fotobanka allphoto, 2011
Vydala Grada Publishing, a.s., U Průhonu 22, Praha 7
jako svou 4577. publikaci
Odpovědná redaktorka PhDr. Alena Palčová
Sazba a zlom Jana Řeháková, DiS.
Počet stran 424 + 64 stran barevných příloh
1. vydání, Praha 2011
Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-3459-0

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

ISBN 978-80-247-7192-2 pro formát PDF
ISBN 978-80-247-7193-9 pro formát EPUB

Předmluva

Publikace „Hematologie a transfuzní lékařství“ je knihou, která je specificky zaměřená na hematologickou a v hematologii používanou laboratorní diagnostiku. Je účelově zpracována především pro obec zdravotních laborantů. Publikace však může mít pochopitelně širší využití u všech odborníků, laiků, kteří mohou z textů čerpat nové nebo upřesňující poznatky potřebné pro svoji specializaci.

Původně mělo dílo zahrnovat čistě hematologickou problematiku, velmi rychle se ale rozrostlo o příbuzný (a vlastně společný atestační) obor transfuzního lékařství a následně i o problematikou, která s hematologií v laboratorní diagnostice souvisí nebo ji významně doplňuje (molekulární biologie, imunocytologie apod.).

Autorský kolektiv byl sestaven z odborníků vlastního hematologického pracoviště ve FN Brno, kteří se jednotlivými segmenty hematologického zaměření zabývají, a z důvodu co nejširšího pojetí zahrnuje lékaře, ale i další specialisty především z laboratorních oborů, včetně zdravotních laborantů.

Publikace je sestavena ze dvou dílů – samostatné hematologické a samostatné transfuziologické části, každá z nich se svou obrazovou přílohou, ale s jednotným uspořádáním, aby mohly vytvořit dvoudílný kompaktní celek.

Úvodem jsou v hematologické části zpracovány kapitoly se spíše teoretickým a obecným zaměřením, pak následují kapitoly speciální problematiky zaměřené na problémové okruhy jednotlivých systémů, jak bývají v hematologii běžně členěny, včetně tabulek normálních hodnot. Samostatnou přílohu tvoří obrázky významnějších nebo instruktivních nálezů, jejich seznam, seznam zkratek a rejstřík.

I když si jsme vědomi, že ve věku elektronického zpracování textů nemá již knižní podoba publikací svoje dominantní místo, zůstává stále pohotovým zdrojem informací. Je stále dost v oblibě u řady čtenářů, proto jsme se rozhodli ji napsat. Věříme, že své čtenáře nezklameme a přineseme jim to, co hledají a očekávají. Jsme si zároveň vědomi nutnosti inovace ve vcelku časném časovém horizontu a pokusíme se tento požadavek takového zpracování rovněž naplnit.

Čtenářům přejeme, aby jim naše práce – ať již jakkoliv – prospěla, a svým spoluautorům děkuji za úsilí a snahu přispět čtenářům ke zmíněnému prospěchu.

Miroslav Penka

Poděkování

Za pomoc při zpracování obrazové dokumentace děkujeme zdravotním laborantkám OKH FN Brno – paní Jaroslavě Hoblové, Monice Antošové, Libuši Antošové.

Autoři kapitoly 3.7 děkují Mgr. Petru Dobešovi z centra molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologické kliniky FN Brno za pomoc při technické realizaci obrázků 3.39, 3.40, 3.41, 3.42, 3.43, 3.44, 3.50, 3.51, 3.58, 3.62, 3.63, 3.64, 3.65.

Naše poděkování patří i recenzentům prof. MUDr. Ladislavu Chrobákovi, CSc., a doc. RNDr. Miroslavu Peckovi, CSc., za jejich pečlivou a precizní práci, kterou s prostudováním naší publikace měli, a za jejich kritickou shovívavost při zpracování recenze.

Poděkování patří také sponzorům, bez jejichž přispění a pomoci by publikace možná sice vznikla, ale byla by neprodejná.

Poděkování patří i všem spoluautorům, kteří se na publikaci podíleli.

1 Fyziologie krvetvorby

1.1 Vznik a vývoj krvetvorby

Krvetvorba (hemopoéza nebo hematopoéza) je v období embryonálního vývoje lokalizována nejprve do oblasti žloutkového vaku, posléze tento úkol přejímají játra a slezina a konečně pak kostní dřeň. Za patologických stavů (hemolýzy, myeloproliferativní onemocnění apod.) může dojít k opětovné aktivaci hemopoézy v játrech a slezině a dokonce i v mízních uzlinách byla popsána nelymfoidní hemopoetická aktivita (zvláště u myeloproliferací). Hemopoéza vznikající v oblasti žloutkového vaku z embryonálních kmenových buněk diferencujících se v kmenové buňky krvetvorby představuje mezoblastové období, začínající asi 14.–20. den embryonálního vývoje. Vytvářejí se ostrůvky primitivních hemopoetických buněk, lemovaných endoteliemi (area vasculosa). Asi ve 4. týdnu života se primitivní cévy žloutkového vaku propojí s cévním systémem embrya. Mezoblastové období trvá asi do 10. týdne nitroděložního života, zároveň se po 6. týdnu vývoje objevuje krvetvorba v mezenchymu mezi hepatocyty a posléze i ve slezině (hepatolienální období). Od 20. týdne nitroděložního vývoje se krvetvorba přesunuje do kostní dřeně. Hlavním hemopoetickým orgánem je kostní dřeň, je zde přítomen „pool“ (anglicky zásoba, termín se v odborném tisku o kmenových buňkách běžně používá) hemopoetických kmenových buněk – pluripotentní kmenová buňka pro všechny řady nelymfoidní i lymfoidní, kmenová buňka pro lymfoidní řadu, multipotentní kmenová buňka pro všechny nelymfoidní řady CFU-GEMM (colony forming unit – granulocytes, erythrocytes, monocytes/macrophages, megakaryocytes), zralejší kmenové buňky v podobě společných prekurzorů pro erytroidní a megakaryocytární linii a pro granulocytární/monocytární linii. Primitivní i vyzrálejší kmenové buňky podléhají tzv. asymetrickému dělení, kdy jedna z dceřiných buněk je identická s mateřskou kmenovou buňkou (self renewal – samoobnovování kmenových buněk) a druhá se dále diferencuje.

1.2 Vývoj krevních buněk

Multipotentní (totipotentní) kmenová buňka jednak v kostní dřeni udržuje relativně stálý počet těchto prekurzorů (self renewal) a na druhé straně dává vzniknout zralejším kmenovým buňkám, tzv. committed cells. Každá krvetvorná řada pak vychází z kmenových buněk pro jednotlivé linie. Eozinofilní a bazofilní řada a navíc i vývoj tkáňových bazofilů vychází ze specifických CFU (CFU-Eo, CFU-Ba a CFU-mast). Lymfoidní řada pak vychází ze společné kmenové buňky pro B a T řadu a NK cells (natural killer). Vývoj krvetvorby v časných fázích (nezralé kmenové buňky) zachycuje obrázek 1.1. Hemopoéza je pod kontrolu řady interleukinů (IL), CSF (colony-stimulating factors) a navíc zde hrají roli interakce kmenových buněk se stromatem hemopoetických orgánů – jde o tzv. hemopoetické induktivní mikroprostředí (HIM). Buněčné elementy HIM tvoří monocyty/makrofágy, endotelie, retikulární buňky aj. umístěné v extracelulární matrix. Teprve souhrou všech těchto faktorů je umožněna normální hemopoéza. Poruchy na úrovni kmenových buněk a/nebo HIM mohou vyústit v nejrůznější patologické stavy (dřeňové útlumy, myelofibrózy, myelodysplazie, akutní hemoblastózy apod.). Výzkum v oblasti kmenových buňek (a nejen hemopoetických) velmi pokročil a dotýká se jak otázek maligního bujení, tak možnosti náhrady tkání (v našem případě hematopoézy) vhodně manipulovanými kmenovými prekurzory.

Obr. 1.1 Časný vývoj krvetvorby

Na obrázku je znázorněna časná hematopoéza. Jednotlivé prekurzorové buňky nejsou identifikovatelné světelnou mikroskopií. Ze znázorněných prekurzorů se pak diferencují zralejší elementy v podobě proerytroblastů, promegakaryoblastů, myeloblastů a elementů T, B nebo nulových lymfocytů. Rovněž jsou znázorněna časná stadia diferenciace mastocytární a dendritické linie. Kmenové buňky se dělí asymetricky – v jednu identickou kmenovou buňku (self renewal) a v committed cell (buňku s další diferenciací). Tak je udržována zásoba (pool) kmenových buněk i diferenciace hematopoézy.

CFU – colony forming unit, BFU – burst forming unit, GEMM – granulocytární, erytroidní/megakaryocytární, monocytární, GM – granulocytární a monocytární, T/NK – T a NK lymfocyty, Meg – megakaryocytární

Kmenové buňky hematopoézy lze studovat řadou metod, nejpřínosnějšími jsou různé kultivační metody in vitro, kdy se využívá jednak různě komponovaných kultivačních médií, a pak i sledování odpovědi na nejrůznější růstové faktory a/nebo jejich kombinace. Každý růstový faktor se váže na specifické receptory, exprimované na povrchu různých hematopoetických prekurzorů, a tím je dána specifičnost jeho působení. Mezi růstové faktory hemopoézy patří interleukiny (IL) – IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, dále erytropoetin (EPO), trombopoetin (TPO), GM-CSF (granulocytární a makrofágové kolonie stimulující faktor), G-CSF (granulocytární kolonie stimulující faktor) c-kit ligand neboli stem cell factor (SCF) a řada dalších. Některé z růstových faktorů se již vyrábějí rekombinantní technologií (vnesením genů kódujících tyto faktory, do vhodných buněk v tkáňových kulturách) a jsou užívány léčebně (např. EPO, TPO a jeho analoga, G-CSF).

Kmenové buňky, kultivované ve vhodných médiích, se mohou dále zkoumat na ultramikroskopické úrovni, průtokovou cytometrií s eventuálním cell-sortingem (přístrojovým sběrem zvolených elementů), transfekcí do vhodných linií pokusných zvířat, sledováním aktivace různých genů detekcí specifických mRNA (messenger ribonukleových kyselin), multi-array analýzou (sledováním aktivace mnoha genů najednou) apod. Jisté struktury na povrchu (v buněčné membráně) jednotlivých řad nám mohou pomoci v detekci diferenciace těchto elementů. Jsou to nejčastěji tzv. CD znaky (clusters of differentiation). Například CD2 je znakem T lymfocytů, CD19 B lymfocytů, CD14 monocytů, CD15 granulocytů, CD16 NK buněk a glykoforin A erytroidní řady (CD235a). Pro kmenové buňky je charakteristickým znakem CD34. Více jak 99 % dřeňových elementů je CD34 negativních, avšak jen určitá část CD34 pozitivních buněk představuje nezralé kmenové buňky. O CD znacích blíže viz kapitola o flow cytometrii.

Mechanizmy vedoucí jednak k nutnému samoobnovování poolu multipotentních buněk a na druhé straně vedoucí k diferenciaci v „committed cells“ jsou jen částečně známy a jejich přesnějším poznáním by mohlo dojít k pokroku v diagnostice i léčbě např. v oblasti hemoblastóz nebo dřeňových útlumů.

V současnosti zaznamenáváme výrazný posun v poznatcích o hierarchii krvetvorby, např. se zdá, že kmenové buňky pro makrofágy a dendritické buňky lze detekovat v časných fázích lymfoidního (nemyeloidního) vývoje.

1.3 Tvorba a vývoj červených krvinek (erytropoéza)

Erytropoéza vychází ze společné linie (kmenové buňky) s megakaryopoézou a dále samostatně postupuje od BFU-E (burst forming unit-erythropoesis) přes CFU-E k již morfologicky diferencovatelným proerytroblastům. Další maturace pak probíhá přes bazofilní, polychromatofilní a oxyfilní erytroblasty k bezjaderným retikulocytům, které jsou vyplavovány z kostní dřeně do periferní krve. Jaderné erytroblasty se v periferní krvi objevují pouze za patologických stavů (vystupňovaná hemolýza, velké ztráty krve, akutní i chronické hemoblastózy, metastázy do kostní dřeně apod.). Celkově jsou erytropoéza a zralé erytrocyty označovány pojmem erytron. V erytronu je udržována dynamická rovnováha mezi zánikem a tvorbou červených krvinek. Hlavním regulačním proteinem erytronu je v ledvinách produkovaný erytropoetin (EPO). Za patologických okolností může nerovnováha v tomto systému vést k anémii nebo erytrocytóze. Nejčasnější identifikovanou buňkou erytronu je tzv. BFU-E (burst forming unit-erythroid). Tyto erytroidní prekurzory při kultivaci in vitro vytvářejí velké kolonie (proto burst = výbuch) dobře hemoglobinizovaných erytroblastů. Zpočátku je tento růst nezávislý na erytropoetinu, ale je zcela závislý na IL-3, později směsi cytokinů EPO, TPO, GM-CSF a stem cell faktoru. Detaily regulace proliferace a diferenciace BFU-E nejsou přesně známy. Morfologickyse jedná o velmi nezralé blasty, mnohdy s pseudopodickými výběžky, vysokým nukleo/cytoplazmatickým poměrem a výraznými nukleoly. BFU-E se postupně diferencují v CFU-E (colony forming unit-erythroid). Jsou to poněkud zralejší blasty, jejichž proliferace je plně závislá na EPO, a nesou na svém povrchu četné receptory pro EPO. Při pokusech na zvířatech vedla anemizace k expanzi počtu CFU-E a naopak polytransfuze k výrazné redukci CFU-E paralelně s koncentrací EPO v krvi. Proerytroblast je první identifikovatelnou buňkou pomocí světelné mikroskopie. Proerytroblast má asi 14–20 μm v průměru, jádro s relativně hrubším chromatinem (oproti myeloblastům a lymfoblastům), v cytoplazmně jsou ultramikroskopicky prokazovány známky počínající syntézy hemoglobinu, četné ribozomy a počínající struktury Golgiho komplexu. V buňkách je přítomen feritin jak difuzně, tak i v podobě organel, nazývaných siderozomy. Cytoplazma proerytroblastu je sytě bazofilní, někdy vytváří pseudopodie, někdy s projasněním u jádra (Golgiho komplex) a jádro tvoří více než 80 % plochy buňky. Bazofilní erytroblast je poněkud menší než proerytroblast (cca 12–17 μm), vykazuje zmenšující se nukleo/cytoplazmatický poměr a hrubší strukturu jádra většinou bez nukleolů. Cytoplazma zůstává sytě bazofilní, i když tato bazofilie může již být méně nápadná. S pokračující diferenciací dochází k progresivnímu zmenšování a pyknotizaci jader erytroblastů a postupné změně barvy cytoplazmy od bazofilní (sytě modrá) přes polychromatofilní (špinavě šedivá) až po růžovou při barvení podle Maye-Gruenwalda-Giemsy. Změna barvy cytoplazmy souvisí s nárůstem hemoglobinu a redukcí ribozomálních komplexů ve zrajících erytroblastech. Polychromatofilní erytroblasty jsou posledním vývojovým stupněm erytropoézy schopným dělení. Jádro je již výrazně kondenzováno a cytoplazma špinavě šedá. Velikost této buňky se pohybuje v rozmezí 12–15 μm. Ortochromní (také oxyfilní) erytroblasty již nejsou schopny dělení, jádro je silně pyknotické, malé a již v něm neprobíhá syntéza deoxyribonukleových kyselin (DNA). Oxyfilní (ortochromní) erytroblasty jsou nejmenšími elementy erytropoézy(8–12 μm), jejich velikost se téměř blíží zralým erytrocytům. Ortochromní erytroblasty však nejsou plně hemoglobinizovány, a proto jejich oxyfilie nedosahuje intenzity, jakou vidíme u zralých erytrocytů. Extruzí jádra, což je aktivní proces za účasti aktinových filament, se oxyfilní erytroblast dále vyvíjí v retikulocyty. Retikulocyty jsou poněkud větší než normální erytrocyty (normocyty) a mají nepravidelný tvar, což je zvláště dobře detekovatelné ultramikroskopicky. Retikulocyty mají zachovanou jistou možnost aktivního pohybu, což se považuje za důležité při přechodu těchto buněk přes endoteliální póry dřeňových sinusoid do periferní krve. V retikulocytech ještě probíhá syntéza hemoglobinu a některé další metabolické pochody, které nejsou prokazatelné ve zralých erytrocytech zvaných normocyty. Některými supravitálními barveními (např. brilliant kresylovou modří – blíže viz příslušná kapitola) lze ve světelné mikroskopii zobrazit v retikulocytu přítomnou ribozomální RNA jako tzv. „substantia reticulofilamentosa“. V retikulocytu však postupně dochází k degradaci RNA ribonukleázami a jinými enzymy, které jsou například blokovány při otravě olovem. RNA bloky jsou pak viditelné při normálním barvení jako bazofilní tečkování (můžeme je však vidět i u řady jiných závažných poruch krvetvorby). Normální retikulocyty vykazují asi o 20 % větší objem než normocyty. Normocyty jsou bikonkávní bezjaderné buňky, nemající vlastní proteosyntézu. Měří asi 7 μm v průměru a vykazují vysoký poměr povrch/objem, což je výhodné pro jejich hlavní funkci – přenášet do tkání kyslík. Pro normální erytropoézu jsou nezbytnou nutností aminokyseliny, železo, vitaminy B12, B6 a kyselina listová a některé další stopové prvky. Při těžké podvýživě (hladovění, mentální anorexie, kachexie) tak rezultuje anémie z kombinovaného deficitu uvedených látek.

Železo je biogenní prvek, který se vyskytuje prakticky ve všech živých organizmech. Najdeme je v jednobuněčných organizmech (kvasinky, bakterie), v buňkách rostlin a v tělech bezobratlých i obratlovců až po savce. Je tomu tak proto, že atom železa je schopen velmi snadno vázat i uvolňovat elektron, a tak měnit své mocenství z dvojmocné feroformy na trojmocnou feriformu a naopak. Železo se ze všech biogenních kovů vyskytuje v organizmu v nejvyšším množství, což obnáší asi 35 mg/kgu žen a 45 mg/kg u mužů. Největší podíl celkového množství železa v organizmu je obsažen v hemoglobinu (60–70 %), asi 10 % je součástí myoglobinu, cytochromů a jiných enzymů, asi 20–30 % tvoří zásobní pool v podobě vazby na feritiny, méně než 1 % je obsaženo v cirkulujícím poolu v krvi. Vedle své nejznámější funkce transportu kyslíku plní železo i řadu dalších vitálních funkcí – je nutné pro syntézu nukleových kyselin (DNA i RNA), syntézu řady proteinů, účastní se řízení buněčné proliferace a diferenciace a apoptózy, je nutné pro syntézu myelinu a formování dendritů neuronů, což se odráží v ovlivňování pochodů učení a paměti. Pozornost řady vědeckých týmů je upřena na úlohu železa v procesech stárnutí tkání, neurodegenerace, maligního bujení, aterosklerózy a role železa v imunitním systému. Železo je v krevním proudu vázáno na bílkoviny. Z největší části jde o transportní protein transferin. Molekula transferinu váže dva atomy trojmocného železa Fe+++. Denně dochází k obratu asi 25 mg železa v krvi. Za normálních okolností je transferin saturován pouze asi ze třetiny své vazebné kapacity. Při nedostatku železa saturace transferinu klesá, naopak při přetížení organizmu železem stoupá. Při rozvoji anémií chronických onemocnění dochází nejčastěji k poklesu koncentrace sérového železa i transferinu (transferin je negativní reaktant akutní fáze), takže saturace transferinu může být normální nebo mírně snížená (záleží na vzájemném poměru poklesu železa i transferinu). Molekula transferinu obsahující železo má vysokou afinitu ke specializovaným receptorům, lokalizovaným na buněčných membránách s nejhustší expresí na buňkách hemopoézy. Byly již popsány 2 typy transferinových receptorů (TfR) – TfR a TfR2.

Zásobní železo je v buňkách uloženo ve formě feritinu. U většiny obratlovců je feritin tvořen dvěma typy podjednotek, označovaných jako L (light, liver) a H (heavy, heart) feritin. Tyto podjednotky se organizují do schránek, z nichž každá je složena ze čtyřiadvaceti molekul L nebo H feritinu. Feritinové schránky jsou schopné každá pojmout několik tisíc atomů Fe+++. Jednotlivé feritiny se od sebe liší zastoupením L a H podjednotek a jsou označovány jako izoferitiny. H feritin je feroxidáza a jeho aktivita usnadňuje rychlou inkorporaci atomu Fe do feritinových komplexůa na druhé straně je toto železo rychleji z feritinu uvolňováno. Izoferitiny, bohaté na L podjednotky, přijímají Fe pomaleji a déle jej skladují. Jednotlivé tkáně a orgány se liší zastoupením exprese a translace mRNA pro L a H podjednotky feritinu. TfR a feritin představují dva hlavní proteiny regulace buněčné homeostázy železa. Při negativní bilanci železa (poruchy vstřebávání, chronické krevní ztráty, gravidita apod.) se postupně rozvíjí karence tohoto prvku. Nejprve dochází k depleci železa v zásobách monocyto-makrofágového systému (MMS), pak klesá saturace transferinu pod 15 % jeho celkové vazebné kapacity a současně stoupá i koncentrace transferinu v krvi. Po vyčerpání zásob železa v MMS i snížení jeho obsahu v krvi se rozvíjí hypochromní mikrocytární anémie, kterou je však nutno odlišit hlavně od anémií chronických onemocnění, hemoglobinopatií a myelodysplastických syndromů, což nebývá ve většině případu příliš obtížné, ale občas bývá diferenciální diagnostika svízelná. Při nedostatku pyridoxinu dochází k poruše syntézy hemu s obrazem mírné hypochromní anémie. Rovněž vzácný nedostatek mědi má také za následek vadnou syntézu hemu s hypochromií. Při nedostatku vitaminu B12 a/nebo kyseliny listové vídáváme obraz makrocytární až megaloblastické anémie, v diferenciální diagnostice těchto stavů nutno především odlišit myelodysplastické syndromy. Makrocytární anémie u chronických onemocnění jater nemívá většinou patrnou výraznější ovalocytózu, která naopak přichází u MDS a perniciózní anémie (vše podrobněji v kapitole zabývající se chudokrevností).

1.4 Hemoglobin

Krevní barvivo hemoglobin tvoří více než 90 % váhy normocytu a aktivace globinových genů je pozorována již na úrovni časné BFU-E. Hemoglobin je utvářen dvěma páry globinových řetězců (tetramer), čtyřmi tetrapyrolovými prstenci v podobě protoporfyrinu IX a čtyřmi centrálně uloženými atomy dvojmocného železa. Atom železa je vázán ve středu každého tetrapyrolového kruhu (obr. 1.2). Protoporfyrin s centrálně umístěným atomem železa nazýváme hem. Globin je tvořen dvěma páry řetězců – asi 97 % představuje tetrametr α2β2 (HbA1), maximálně 3,2 % představuje tetrametr α2δ2 (HbA2) a pouze stopy připadají na HbF (β2γ2) – fetální hemoglobin. Struktura hemoglobinu se mění během embryonálního, fetálního a postnatálního života. Embryonální a fetální hemoglobiny vykazují vyšší aktivitu ke kyslíku než adultní hemoglobiny (snadnější přebírání kyslíku z mateřské krve). Geny pro globinové řetězce jsou lokalizovány na chromozomech 16 (tzv. α-like cluster) a 11 (β-like cluster). Podrobnější popis překračuje rámec této učebnice, lze jen shrnout, že v dospělosti jsou aktivní β, α a δ geny a že poruchy v aktivaci jednotlivých genů (poruchy struktury genů, poruchy transkripce a/nebo translace) vídáváme u talasemií a méně často u myeloproliferací a myelodysplazií. Talasemie se endemicky vyskytují v oblastech kolem Středozemního moře a v jihovýchodní Asii. U bílé rasy jde nejčastějio β talasemii s poruchami syntézy β řetězců. V erytrocytech klesá koncentrace HbA1 a zvyšuje se hladina HbA2 a HbF. Podle stupně postižení hovoříme o talasemii minima, minor a maior. Společným znakem talasemií je pokles koncentrace hemoglobinu, hypochromie a nápadně snížený střední objem červených krvinek, v krevním nátěru lze nalézt různý počet terčovitých erytrocytů (tzv. target cells). V diferenciální diagnóze je nutno vyloučit především anémie z nedostatku železa a v endemických oblastech i jiné hemoglobinopatie (HbS, HbE, HbC, HbD aj.). Striktně vzato nepatří talasemie mezi klasické hemoglobinopatie, jelikož jde většinou o kvantitativní (snížení syntézy) a ne kvalitativní poruchu (patologické hemoglobiny s odlišnou strukturou). Nejčastějšími hemoglobinopatiemi v užším smyslu slova jsou hemoglobiny S, C, D a E (blíže v kapitole věnované anémiím).

Syntéza tetrapyrolového kruhu začíná aktivací genu pro δ aminolevulonátsyntázu (ALAS). Z δ aminolevulonové kyseliny a porfobilinogenu je syntetizován uroporfyrinogen – izomery I a III – jde již o tetrapyrolový kruh. Přes koproporfyrinogen III a protoporfyrinogen III je syntetizován finální produkt – protoporfyrin IX.Enzym hemsyntetáza pak inkorporuje do protoporfyrinu IX atom dvojmocného železa a vzniká tak hem. Hem se mimo své hlavní funkce přenašeče kyslíku v hemoglobinu vyskytuje např. i v cytochromech, peroxidázách a myoglobinu. Hem plní i regulační funkce – stimuluje syntézu globinových řetězců i jiných proteinů. Při poklesu lokální koncentrace hemu dochází k útlumu syntézy těchto bílkovin. Při vrozených a/nebo získaných poruchách funkce enzymů syntetizujících jednotlivé porfyriny vznikají tzv. porfyrie.

Obr. 1.2 Schéma molekuly hemoglobinu

Hemoglobin se skládá ze dvou párů globinových řetězců, čtyř cyklických protoporfyrinů IX a čtyř atomů dvojmocného železa, umístěných v centru každého protoporfyrinu. Více než 97,5 % hemoglobinu dospělých představuje hemoglobin HbA1, skádající se ze dvou řetězců α a ze dvou řetězců β (α2β2). Za normálních okolností dosahuje minoritní hemoglobin A2 (α2δ2) maximálně 3,3 % celkového cirkulujícího hemoglobinu. Při poruše syntézy β řetězců (β talasemie) se zvyšuje podíl HbA2 a HbF (α2γ2) v cirkulaci.

1.5 Tvorba a vývoj bílých krvinek

Granulopoéza a monocytopoéza vycházejí ze společné kmenové buňky CFU-GM, ze které se pak diferencují kmenové buňky pro granulopoézu (CFU-G) a monodendritický prekurzor s další diferenciací v monocyto-makrofágovou linii (CFU-M) a dendritický prekurzor (obr. 1.1). Pomocí morfologických, cytochemických, ultrastrukturálních a imunologických metod můžeme odlišit myeloblasty od monoblastů. Myeloblasty se dále diferencují v promyelocyty, nezralé a zralé myelocyty, metamyelocyty, tyčky a segmentované neutrofily. Monoblasty se diferencují v promonocyty a zralé monocyty/makrofágy.

Morfologicky lze v kostní dřeni identifikovat prekurzorové buňky bílé řady až ve stadiu myeloblastů. Jedná se o cca 10–18 μm velké nezralé elementy s vysokým nukleo/cytoplazmatickým poměrem s jemným jaderným chromatinem s 2–5 prominujícími nukleoly. Jádro myeloblastu má zpravidla jemnější strukturu než jádro proerytroblastu a cytoplazma je méně bazofilní. Jádro se jeví síťovitě nebo vláknitě uspořádané, někdy má chromatin podobu jemných krupiček a je uloženo centrálně. V cytoplazmě myeloblastů mohou být detekována nečetná primární (azurofilní) granula, která vykazují pozitivní reakci na myeloperoxidázu, někteří autoři však blasty s nečetnými primárními granulami řadí již k promyelocytům. V případě leukemických myeloblastů většina autorit granula připouští (leukemické blasty I–III) (blíže v kapitole o leukemiích).

Dalším vývojovým stadiem myelopoézy jsou promyelocyty. Tyto buňky jsou nápadné svou velikostí (12–20 μm), mají zpravidla excentricky uložené jádro s hrubší strukturou chromatinu než myeloblasty s většinou dobře patrnými nukleoly. Jádro často vykazuje lehké vyhloubení jaderné membrány, ve kterém je patrné zřetelné projasnění cytoplazmy. Ultramikroskopicky je v této lokalizaci detekován tzv. Golgiho komplex (slouží ke třídění a „balení“ v buňce syntetizovaných makromolekul do granul). Cytoplazma promyelocytů si zachovává bazofilní barvení a jsou v ní patrná četná primární granula. Tato primární granula jsou syntetizována v promyelocytech a myelocyty je již netvoří, jsou však detekovatelná ve všech vývojových stadiích granulopoézy, včetně nejzralejších segmentů. Primární granula jsou velká asi 500 nm, jejich membrána nese četné antigenní struktury (CD63, CD66c, CD68) a obsahují myeloperoxidázu, lysozym, elastázu, defenziny a mnoho dalších látek, hrajících roli v obraně organizmu proti infekci a v remodelaci tkání. Primární granula se již dále nevyvíjejí, jen perzistují. V promyelocytech nejsou přítomna sekundární granula.

Myelocyty se vyznačují poklesem nukleo/cytoplazmatického poměru, hrubší strukturou chromatinu a zvyšujícím se počtem sekundární granulace (neutrofilní, eozinofilní a bazofilní – v závislosti na diferenciaci). Sekundární granula jsou menší než primární, mají průměr cca 200 nm a jsou negativní na myeloperoxidázu. Na povrchu nesou četné struktury jako CD15, CD66a, CD66b a mnoho dalších, obsahují kolagenázu, lysozym, histaminázu, heparinázu, vitamin B12 vázající protein, aktivátor plazminogenu, laktoferin aj. Sekundární granula jsou na hranici viditelnosti světelným mikroskopem. Cytoplazma neutrofilních myelocytů pozbývá bazofilního zabarvení ve prospěch eozinofilního (růžového) odstínu. Ve zralejších elementech myeloidní řady se navíc popisují i terciální granula, rovněž obsahující různé proteiny, především želatinázu a lysozym.

Lze detekovat nezralé a zralé myelocyty. V nezralých myelocytech vidíme bazofilnější zabarvení cytoplazmy, jemnější strukturu jádra a vzácně mohou být patrné i nukleoly. Nukleoly jsou dobře patrné ultramikroskopicky. Myelocyty představují nejzralejší myeloidní elementy, které mají ještě schopnost buněčného dělení. Velikost těchto buněk se pohybuje mezi 12–18 μm.

Metamyelocyty jsou poněkud menší než myelocyty (10–18 μm), mají menší a hutnější jádro, které většinou vykazuje ledvinovitý tvar. Tyto buňky se za fyziologických okolností, stejně jako jejich dříve zmíněné prekurzory, vyskytují jen v kostní dřeni, nikoli v periferní krvi. Za normálních okolností se v periferní krvi vyskytují pouze tyče a segmenty. Rozdíl mezi tyčemi a segmenty se kupodivu v literatuře uvádí různě jako poměr tloušťky mezi nejtenčím a nejširším místem jádra – různí autoři hovoří o jedné třetině nebo polovině, jiní dokonce za segmenty považují až elementy s vlákénkovitým (jako nit tenkým) spojením mezi částmi jádra.

Zralé tyče a segmenty jsou uvolňovány do periferní krve. Přesný mechanizmus regulace tohoto procesu není znám. Poločas zralých elementů v periferní krvi obnáší asi 6 hodin. Zralé neutrofily jsou atrahovány do míst infekce a/nebo poškození tkání, kde dochází k interakci s endoteliemi s následným vycestováním do tkání na bázi chemotaxe.

Osud zralých neutrofilních leukocytů u zdravých lidí bez infekce nebo poranění není zcela jasný, zdá se, že část je eliminována přestupem sliznice gastrointestinálního traktu.

Eozinofilní řada, bazofilní řada a mastocyty vycházejí ze společného prekurzoru, pozitivního na CD34 znak a dosud nenesoucího specifické receptory pro IgE (Fc epsilon R). Tento prekurzor se pak diferencuje v již odlišené kmenové buňky pro mastocyty (CFU-Mast) a pro Eo/Bazo řadu. Kmenová buňka pro mastocytární řadu má na buněčné membráně na rozdíl od společné kmenové buňky pro eozinofilní/bazofilní řadu receptor pro SCF (stem cell factor) – c-kit. Společná kmenová buňka pro eozinofilní/bazofilní řady vyzrává přes stadia pre-Ba/Eo, common Ba/Eo v již oddělené prekurzory CFU-Eo a CFU-Bazo.

Eozinofilní řada pak již vychází ze specifické kmenové buňky CFU-Eo, dále se diferencující ve zralejší blasty a dále v eozinofilní promyelocyty, metamyelocyty, tyče a segmenty. K této diferenciaci je zapotřebí IL-3, IL-5 a GM-CSF. Sekundární eozinofilní granula vykazují specifickou strukturu v elektronové mikroskopii a obsahují řadu prozánětlivých cytokinů, bazický protein, kationický protein, neurotoxin a eozinofilní myeloperoxidázu.

Bazofilní granulocyty se diferencují z kmenové buňky CFU-bazo v bazofilní myeloblasty, promyelocyty, metamyelocyty a zralé segmenty. Bazofily se liší od mastocytů v řadě parametrů. Ve světelné mikroskopii je nejnápadnějším rozdílem vzhled jádra a počet a velikost bazofilních granul. Jádro bazofilu je na rozdíl od mastocytu laločnaté, granula mastocytu jsou většinou větší, ale vždy velmi početná, zakrývající jádro. V elektronové mikroskopii jsou tyto rozdíly jasně patrné. Bazofily a mastocyty se liší i obsahem specifických granul a expresí znaků na buněčné membráně. Obě řady obsahují histamin, chondroitin sulfát a destičky aktivující faktor (PAF), mastocyty navíc i heparin a daleko více mediátorů zánětu. V řízení proliferace a diferenciace mastocytů hraje hlavní roli SCF (stem cell factor nebo c-kit ligand), zatímco v bazofilní řadě IL-3, IL-5, GM-CSF a TGFβ (transforming growth factor β).

Monocyto-makrofágová řada se diferencuje ze společného prekurzoru s granulopoézou (CFU-GM). CFU-GM vyzrává v CFU-G a monodendritický prekurzor. CFU-G dává vzniknout granulopoéze a monodendritický prekurzor se dále diferencuje ve dvě větve: nezralé elementy dendritické řady a monoblasty. Monoblasty lze ve světelné i elektronové mikroskopii jen velmi obtížně odlišit od myeloblastů. Monoblasty mohou být různě výrazně pozitivní na nespecifickou esterázu se zřetelným blokem reakce natrium fluoridem (NaF), myeloperoxidázová reakce v nich bývá zpravidla negativní nebo jen lehce pozitivní. Téměř specifická pro myeloidní řadu je reakce na chloroacetátesterázu, naproti tomu pro monocytární řadu je téměř specifická reakce na butyrátesterázu s následným blokem NaF.

Zralejší promonocyty již více připomínají monocytární elementy, mají většinou ledvinovité jádro s retikulárním chromatinem, kde ještě můžeme nacházet různě zřetelné nukleoly. Cytoplazma je bazofilní, ale již může pomalu nabývat typické kouřovité zabarvení. Zralé monocyty mají nepravidelné (většinou ledvinovité) jádro bez nukleolů a cytoplazma je kouřově šedá s jemnou (poprašek) azurofilní granulací. Monocyty vycestovávají do tkání, kde je označujeme jako makrofágy. Makrofágy jsou přítomny prakticky ve všech tkáních a orgánech, v některých mohou plnit specifické funkce (např. osteoklasty v kostní tkáni, mikroglie v mozku, Kupfferovy buňky v játrech, Langerhansovy buňky v kůži). Základními funkcemi monocyto-makrofágového systému jsou fagocytóza mikroorganizmů, eliminace a prezentace antigenů, výrazná účast na remodelaci tkání, destrukce starých nebo poškozených erytrocytů s nemalým podílem na ovlivnění metabolizmu železa. S buňkami monocyto-makrofágového systému funkčně i vývojově spřízněné dendritické buňky detekujeme v primárních i sekundárních lymfatických orgánech (viz níže) a sliznicích, kde je nacházíme jako epiteliální, folikulární nebo interdigitující elementy. Dendritické buňky nesou na svém povrchu početné antigeny hlavního histokompatibilního komplexu (MHC – main histocompatibility complex) a prezentují v tomto kontextu cílové antigeny T lymfocytům.T lymfocyty mohou být následkem této interakce aktivovány. Při těchto pochodech je rovněž uvolňována jak lymfocyty, tak i dendritickými buňkami řada mediátorů. Prezentace antigenů se účastní i buňky monocyto-makrofágového systému.

Lymfocytární řada prodělává vzhledem ke svým zásadním regulačním funkcím v imunitních pochodech dosti složitý vývoj. Po diferenciaci ze společné multi (toti)-potentní buňky pro nelymfoidní i lymfoidní řadu se lymfoidní kmenové buňky dále diferencují do T řady nebo B řady.

Lymfoblasty jsou zpravidla poněkud menší než myeloblasty s úzkým lemem cytoplazmy kolem kulatého jádra s hutnějším chromatinem a zpravidla obsahují jen 1–2 nukleoly. Lymfoblasty jsou peroxidáza negativní. V jádrech nezralých prekurzorů lymfatické řady lze detekovat enzym terminální deoxynukleotidyl transferázu (TdT), který je pozitivní u cca 90 % akutních lymfoblastických leukemií a jen vzácně u akutních myeloidních leukemií. Prolymfocyty jsou menší než lymfoblasty s hutnějším jádrem a většinou dobře patrným centrálním nukleolem. Zralé lymfocyty se vyznačují velkou morfologickou i funkční variabilitou a plasticitou. Pro vývoj lymfocytů jsou zásadními primární a sekundární lymfatické orgány. Primárními lymfatickými orgány jsou kostní dřeň a thymus. Lymfocyty se zde diferencují v B a T lymfocyty. Diferenciace T lymfocytů probíhá v tymu. Tymus se skládá z lalůčků (lobulů), kde diferencující se lymfocyty přicházejí do kontaktu s epiteloidními a interdigitujícími dendritickými buňkami a makrofágy, které jak přímým kontaktem, tak produkcí řady cytokinů indukují vyzrávání ve zralé T helper (CD4+) nebo T supressor (CD8+) lymfocyty. T i B lymfocyty, které opouštějí primární lymfatické orgány a dosud se nesetkaly s cílovými antigeny, označujeme jako naivní. Po setkání s cílovými antigeny (může jít o infekční agens, tumory nebo i tělu vlastní nepatologické antigeny v případě autoimunitních onemocnění) se lymfocyty stávají „paměťovými buňkami“ – memory cells nebo efektorovými lymfocyty v podobě plazmatických buněk (B lymfocyty) nebo cytotoxických T lymfocytů. Memory cells při opětovném setkání s antigeny vytvářejí klony, které rychle reagují tvorbou protilátek (B lymfocyty) nebo buňkami zprostředkovanou imunitní reakcí (T lymfocyty). Tvorbou a uvolňováním řady stimulačních i inhibičních cytokinů je pak ovlivněna i reakce ostatních složek imunitní odpovědi (granulocytů, monocytů/makrofágů, žírných buněk, retikulárních buněk). Lymfocyty tak představují centrální buňky v procesech i regulaci imunitní odpovědi a hovoříme zde o specifické celulární i humorální imunitě, na rozdíl od nespecifické imunity, představované komplementem a ostatními nelymfoidními buňkami.

Sekundárními lymfatickými orgány jsou lymfatické uzliny a slezina. Lymfatické uzliny mají aferentní a eferentní lymfatické cévy, přes které protéká lymfa s lymfocyty. Uzliny obsahují lymfatické folikuly, tvořené převážně B lymfocyty. V centru folikulů proliferují morfologicky „nezralé“ centroblasty, diferencující se ve zralé centrocyty. Centroblasty jsou různě veliké, mají zpravidla „naštěpené“ jádro. Velikost, nukleo/cy-toplazmatický poměr a bazofilie cytoplazmy závisí na antigenní stimulaci v regionální lymfatické uzlině. Ve folikulech je přítomna i jistá populace T lymfocytů, které se účastní modulace imunitní odpovědi i pochodů celulární imunity. T lymfocyty jsou přítomny hlavně v plášťové (mantle) zóně lymfatických folikulů. Výrazně proliferující morfologicky „nezralé“ lymfocyty jsou někdy označovány jako imunoblasty (B i T). Tyto buňky jsou zvláště při virových infekcích (nejmarkantněji při infekční mononukleóze) vyplavovány do periferní krve, kde jsou detekovány jako morfologicky velmi heterogenní populace, souhrně některými autory označovaná jako „virocyty“ (také nepřesně jako lymfomonocyty, přesněji aktivované lymfocyty).

V regionálních lymfatických uzlinách a v lymfatických folikulech ve silznicích makrofágy a dendritické buňky prezentují cílové antigeny naivním i paměťovým lymfocytům, které pak recirkulují a znovu se mohou usazovat v místech antigenní stimulace (homing). Lymfatické folikuly ve sliznicích gastrointestinálního traktu nazýváme Peyerovy plaky. Postavení sleziny v řízení diferenciace lymfatické řady a v řízení specifické imunitní odpovědi není zcela jasné, představuje vzhledem ke své velikosti a struktuře značný rezervoár T i B lymfocytů. U splenektomovaných (zvláště pro úraz a ne pro hematologická onemocnění) však nejsou výše uvedené procesy proliferace a diferenciace lymfocytů výrazněji narušeny.

Proliferaci a diferenciaci B lymfocytů lze rozdělit na antigenu nezávislé a závislé období. Prvé období probíhá v kostní dřeni, kdy ze z kmenových buněk postupně diferencuje nezralý pro-B element, CD34+ a CD19+. Další fází je pre-B buňka, která se dále diferencuje ve zralý naivní B lymfocyt. Nevelká populace těchto lymfocytů nese společné znaky pro T (CD5) a B řadu (CD19). U typické chronické lymfatické leukemie je většina leukemických lymfocytů CD5+CD19+. Naivní lymfocyty po setkání s cílovými antigeny buď podléhají apoptóze (negativní selekce, eliminují se tak zvláště autoreaktivní klony), nebo se diferencují v plazmocyty, tvořící protilátky proti cílovému antigenu. Další možností je diferenciace v paměťové buňky, které recirkulují. Při dalším setkání s příslušnými antigeny jsou rychleji produkovány klony plazmocytů produkující protilátky. V této řadě lze rozlišit plazmablast, proplazmocyt a zralý plazmocyt.

Velmi zajímavou a důležitou kapitolou je postupná aktivace genů pro imunoglobuliny v B prekurzorech. Široký repertoár specifických imunoglobulinů je syntetizován jednotlivými klony B lymfocytů. Každý klon je zodpovědný za tvorbu protilátky, zaměřené pouze proti určitému antigenu nebo antigenní determinantě. Protilátky jsou tvořeny dvěma páry těžkých a dvěma páry lehkých řetězců, podle struktury těžkého řetězce pak rozeznáváme 5 tříd imunoglobulinů: IgM, IgG, IgD, IgE a IgA. Specifita a jedinečnost každé protilátky je zajištěna specifickou strukturou (hyper)variabilní části molekuly, která pak rozeznává antigen na principu jedinečnosti klíče a zámku. Variabilní části molekul imunoglobulinů jsou kódovány variabilními úseky genů, které vykazují (hyper)mutace. V časném stadiu vývoje B lymfocytu lze molekulárně biologickými metodami detekovat nejprve aktivaci – přestavbu (gene rearrangement) genu pro těžké řětězce μ, následovanou přestavbou genů pro lehké řetězce κ a λ. Posléze dochází i k aktivaci genů pro těžké řetězce δ, α, ε a γ. Prvními molekulami v cytoplazmě B buněk jsou tak imunoglobuliny IgM, které jsou pak exprimovány na cytoplazmatické membráně jako receptory pro antigeny. IgM jsou na povrchu B buněk postupně vystřídány molekulami IgD. V jednotlivých klonech B lymfocytů jsou v závislosti na aktivaci příslušného genu pro těžké řetězce syntetizovány imunoglobuliny IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. V úsecích genů, které kódují hypervariabilní oblasti protilátek (úseky, rozeznávající antigeny), dochází k „hypermutacím“. Vzniká tak široký rejstřík buněčných receptorů a protilátek. Klony těchto B buněk (již zmíněné centroblasty) se diferencují v centrocyty, které podléhají apoptóze (negativní selekce autoreaktivních klonů), nebo se diferencují v plazmocyty nebo paměťové buňky. Jak již bylo řečeno, tyto procesy jsou ovlivňovány antigen prezentujícími dendritickými buňkami a T lymfocyty.

Vývoj zralých T lymfocytů probíhá (viz výše) v tymu. Podobně jako u imunoglobulinů je struktura buněčných receptorů T lymfocytů (TCR – T-cell receptor) polymorfní a jedinečná pro každý vyvíjející se T klon. Rozeznáváme dva typy TCR: TCR z řetězců α a β a TCR z řetězců γ a δ. Nezralé tymocyty exprimují na svém povrchu CD34, postupně pak CD2, CD5, CD7 a v cytoplazmě CD3. Z hlediska funkce tymocytů jsou důležité antigeny CD4 a CD8. Nejméně zralé buňky jsou CD4- CD8-, pak následují lymfocyty CD4+ CD8+ (double positive) a konečně CD4+ nebo CD8+.

Přestavba s následnou aktivací genů pro TCR (gene rearrangement) začíná v genu pro β řetězec TCR. Následně se diferencují již zmíněné CD4+ CD8+ buňky. Dalším krokem je rearrangement v genu pro α řetězec s kompletizací TCR α/β. Menšina tymocytů aktivuje geny γ a δ a kompletuje tak TCR γ/δ. Tyto lymfocyty jsou morfologicky patrné jako velké granulární lymfocyty a tvoří tak část populace LGL (large granular lymphocytes). Naivní zralé T lymfocyty pak ve spolupráci s dendritickými buňkami podléhají negativní a pozitivní selekci, kdy autoreaktivní a nereaktivní lymfocyty jsou eliminovány indukcí apoptózy (programovaná buněčná smrt) a na cizí antigeny přiměřeně reagující klony jsou uvolňovány z tymu do cirkulace. Zralé T lymfocyty jsou cca 5–8 μm velké buňky s malým lemem cytoplazmy kolem hutně vyhlížejícího jádra s malým počtem organel v světle modré cytoplazmě.

CD4+ a TCR α/β nesoucí T lymfocyty jsou induktory a regulátory specifické imunitní odpovědi (T helper cells). Diferencují se v Th1 a Th2 buňky, lišící se spektrem produkce cytokinů. Th1 lymfocyty indukují reakce cytotoxických T a NK lymfocytů a zvyšují potenci monocyto-makrofágového systému, zatímco Th2 buňky aktivují protilátky produkující B lymfocyty.

CD8+ a TCR α/β buňky představují primárně cytotoxické T lymfocyty. Tyto buňky po stimulaci antigenem (prezentace dendritickými buňkami – první signál) exprimují receptor pro IL-2. Jako druhý signál k proliferaci cytotoxického T klonu slouží navázání IL-2 na tento receptor. IL-2 je sekretován aktivovanými Th1 lymfocyty. Aktivované cytotoxické CD8+ lymfocyty potom indukují apoptózu cílové antigeny nesoucích buněk poškozením membrány i jádra těchto elementů.

Nulové lymfocyty (null-cells) se vyvíjejí nejspíše ze společných kmenových buněk s klasickými T lymfocyty (T/NK prekurzory), nenesou však na svém povrchu většinu znaků pro B a T řadu. Jde o funkčně i fenotypicky heterologní populaci lymfocytů, které ve světelném mikroskopu označujeme jako velké granulární lymfocyty (LGL – large granular lymphocytes). Jedná se o velké buňky (10–12 μm) s vysokým podílem bledě modré cytoplazmy s azurofilními granulami, které jsou peroxidáza negativní. LGL mohou být zastoupeny v periferní krvi asi v 10–15 % z lymfocytární řady. Část LGL je pozitivní na CD56 a negativní pro CD8 a TCR. Tyto elementy jsou skutečnými přirozenými zabíječi (NK cells, nature killer), které mohou být cytotoxické bez předchozí aktivace antigenem. Populace CD56-CD57+CD8+TCR α/β+ se označuje jako NK-like cells. Nulové buňky jsou angažovány v regulaci hematopoézy, obraně proti infekcím a imunitním dozoru proti nádorům. Část populace LGL tvoří TCR γ/δ pozitivní lymfocyty (viz výše).

Pomocí molekulárně genetických metod, detekujících přestavbu genů pro imunoglobuliny v B lymfocytech (a analogicky genů pro T buněčné receptory v T lymfocytech) lze lépe diagnostikovat časné prekurzory jednotlivých řad u akutních lymfoblastických leukemií.

1.6 Tvorba a vývoj trombocytů

Megakaryocytární linie se vyvíjí z kmenové buňky BFU-Meg (BFU-MK) v CFU-Meg, která se pak diferencuje v promegakaryoblasty, megakaryoblasty, promegakaryocyty a nezralé a zralé megakaryocyty. Trombocyty vznikají odštěpováním cytoplazmy zralých megakaryocytů, které se již dále nedělí, pouze dochází k mnohonásobnému zmnožení genomu (2N-4N-8N...) v jádře, tzv. endomitóza. V oblasti cytoplazmy zralých megakaryocytů lze detekovat vznik demarkačních membrán lemujících úseky, které se někdy označují jako prototrombocyty. Prototrombocyty jsou fragmentací uvolňovány do kapilárního systému v kostní dřeni. Terminologie jednotlivých vývojových stadií vývoje megakaryocytární linie není zcela ujednocena – klasickou morfologií neidentifikovatelné stadium tohoto vývoje je nejčastěji označováno jako promegakaryoblast. V těchto blastech však již může být ultrastrukturálně pozitivní reakce na pro trombocyty specifický GP IIb (glykoprotein IIb), dále pak von Willebrandův faktor a peroxidázu. Promegakaryoblasty tvoří cca 5–20 % celého megakaryocytárního poolu. Morfologicky jde o malé „lymfoidně“ vyhlížející blasty s vysokým nukleo/cytoplazmatickým poměrem, výrazně bazofilní cytoplazmou bez granul, flowcytometricky je již ve většině promegakaryoblastů prokazována endomitóza (duplikace genomu bez dělení jádra).

Dalším diferenciačním stadiem je megakaryoblast, někdy je označován za nezralý megakaryocyt I, který představuje asi 20 % megakaryocytární populace. Ve světelné mikroskopii se jedná o asi 6–20 μm velkou buňku s intenzivně bazofilní cytoplazmou, jádro je velké, kulaté nebo lobulizované, nukleo/cytoplazmatický poměr je vysoký, jádro obsahuje několik prominujících nukleolů. Elektronová mikroskopie odkryje několik pro megakaryocyty typických α granul a ojedinělé struktury vznikajícího demarkačního membránového systému. Cytoplazma megakaryoblastů může někdy vytvářet výběžky a občas vídáme adherenci zralých trombocytů na tyto prekurzory, což může pomoci v morfologické diagnostice. Tyto nálezy však bohužel nejsou jednoznačně spolehlivé.

Megakaryoblasty se dále diferencují v promegakaryocyty, místy označované jako zrající megakaryocyt II. Jde o buňky velikosti 15–20 μm se snižujícím se nukleo/cytoplazmatickým poměrem a vyhasínající bazofilií cytoplazmy, která má již narůžovělé tóny. Jádro je již výrazně lobulizované s násobkem genomu mezi 8N a 64N, hrubší struktury a většinou bez výrazných nukleolů. Ultramikroskopicky již nacházíme četnější α granula a struktury demarkačního membránového systému. Promegakaryocyty (megakaryocyty II) jsou v megakaryocytární populaci zastoupeny v asi 25 %.

Zrající a vyzrálé megakaryocyty (megakaryocyty III) se vyznačují postupnou výraznou ztrátou bazofilie cytoplazmy, nápadnou polarizací jádra na okraj cytoplazmy, výraznou lobulizací (ne segmentací) hutného chromatinu bez nukleolů. U zcela zralých megakaryocytů je zřejmé zřetelné „políčkování“ cytoplazmy s následnou fragmentací v podobě uvolňování destiček. V cytoplazmě zralých megakaryocytů lze detekovat redukci endoplazmatického retikula a Golgiho komplexů, naopak dochází k výraznému vývoji demarkačního membránového systému, expresi destičkových glykoproteinů GP IIb/IIIa, komplexu GP I/V/I a zmnožení α granul, hutných tělísek (dense bodies) apod. Zralé megakaryocyty jsou rovněž největší z celé této vývojové řady (cca 40–60 μm v průměru), nejfrekventnější (cca 60 % megakaryocytární řady) a vykazují rovněž nejnižší nukleo/cytoplazmatický poměr. Vývoj zralého megakaryocytu trvá asi 5–10 dní.

Trombocytopoéza není dosud do všech detailů prozkoumána. Nejčastěji se uvádí teorie o extenzi výběžků cytoplazmatických membrán (tzv. pseudopodií) megakaryocytů do kapilárního systému sinusoid v kostní dřeni s následným uvolňováním preformovaných útržků cytoplazmy megakaryocytů v podobě trombocytů do cirkulace. Odhaduje se, že jeden megakaryocyt je schopen vyprodukovat 1000–5000 destiček. Kontakt mezi megakaryocyty a sinusoidami ve dřeni je velmi důležitý jak z hlediska modulace megakaryo/trombocytopoézy přímým intercelulárním kontaktem (cell to cell), tak i pro produkci řady interleukinů a cytokinů, které ovlivňují vyzrávání megakaryocytů i produkci destiček (hematologické induktivní mikroprostředí – HIM), včetně interakce všech zúčastněných složek s tzv. extracelulární matrix.

Počet destiček v periferní krvi je citlivě regulován a ukazuje se, že hlavním proteinem řídícím procesy megakaryo/trombocytopoézy je trombopoetin (TPO). TPO vykazuje asi 20% homologii s erytropoetinem (EPO) a usuzuje se, že geny pro oba proteiny se vyvinuly ze společného základního genu. Do této mozaiky dobře zapadá i existence společného prekurzoru pro erytropoézu a trombocytopoézu. V pokusech na zvířatech bylo zjištěno, že markantní umělé snížení počtu trombocytů vede ke stimulaci megakaryopoézy a trombocytopoézy následkem zvýšené hladiny TPO v krvi. Naopak po mnohočetných trombocytárních transfuzích koncentrace TPO klesá a dochází i k redukci megakaryo/trombocytopoézy. TPO se váže na specifické receptory (označované jako c-MPL), které jsou umístěny na kmenových buňkách, megakaryocytech a trombocytech. Vazba TPO na c-MPL na trombocytech pravděpodobně částečně zabraňuje interakci TPO s c-MPL na kmenových buňkách a zralejších prekurzorech megakaryopoézy. Částečně je tak vysvětlen inverzní vztah mezi počtem krevních destiček a koncentrací TPO v krvi. Lze shrnout, že TPO po vazbě na c-MPL zvyšuje počet i diferenciaci buněk megakaryocytární linie včetně zvýšené tvorby destiček a že koncentrace TPO je v inverzní relaci s počtem trombocytů, přesněji s celkovou trombocytární masou v periferní krvi.

Na vývoji megakaryocytární řady se v určitých stadiích diferenciace megakaryopoézy podílejí i některé další regulační proteiny (IL-3, IL-6, IL-11 a G-CSF), avšak řídicí funkci TPO nenahrazují, jenom ji doplňují. Z celkové trombocytární masy je asi třetina lokalizována ve slezině, u splenektomovaných nemocných se může objevit trombocytóza. Regulační funkce sleziny není zcela jasná, nebyla prokázána produkce stimulačních a/nebo inhibičních faktorů ve slezině. Zdá se, že slezina je hlavním místem zániku „starých“ destiček, destiček poškozených nebo destiček s navázanýni autoprotilátkami (ITP – idiopatická nebo imunitní trombocytopenická purpura). U pacientů se splenomegalií často vídáváme trombocytopenii různého stupně. Dalšími místy destrukce starších trombocytů jsou játra a kostní dřeň, slezina zde však hraje hlavní roli. Denně se vyprodukuje a u zdravého člověka zanikne asi 1,2–1,5 × 1011 trombocytů.

Vztah mezi bilancí železa a trombocytopoézou je diskutován v důsledku pozorování trombocytóz u některých pacientů se sideropenií. Železo má jako kofaktor řady enzymů vliv na syntézu nukleových kyselin, bílkovin, dále na regulaci procesů proliferace, diferenciace a apoptózy různých buněčných linií. U těžkého deficitu železa byly zaznamenány i trombocytopenie. Můžeme říci, že vliv železa na produkci trombocytů není jasný – pacienti mohou mít normální, zvýšený nebo snížený počet destiček v periferní krvi a dosud nebyla realizována žádná klinická studie v tomto směru, jde jen o publikované kazuistiky. S ohledem na významnou podobnost molekuly TPO a EPO je však pravděpodobné, že vede-li sideropenie k anémii a tím i  zvýšení EPO, mohou vysoké hladiny EPO stimulovat kromě erytropoézy i trombocytopoézu a vést tak k reaktivní trombocytóze. Po upravě hladiny Hb se zpravidla normalizují i počty trombocytů.

Na závěr kapitoly o krvetvorbě lze uvést, že hematopoéza má u zdravého člověka velkou rezervu – podle potřeby může mnohonásobně (až 10×) zvýšit produkci jednotlivých krevních elementů. Za patologických stavů (útlumy kostní dřeně, inefektivní hematopoéza, metastázy do dřeně) je tato rezerva snížena až vyčerpána.

1.7 Hodnocení

Stav hematopoézy v praxi nejčastěji hodnotíme korelací nálezů v periferní krvi s nálezy v kostní dřeni. Izolované nebo různě kombinované cytopenie mohou vykazovat útlum (hypoplazie až aplazie) krvetvorby v kostní dřeni, inefektivní hematopoézu (apoptózu zralejších elementů ve dřeni), myelofibrózu, akutní hemoblastózy, metastázy maligních tumorů apod. U obrazů zvýšené proliferace nutno rozlišit primární a sekundární procesy (např. reaktivní leukocytózu od chronické granulocytární leukemie). Kromě klasických metod hodnocení hematopoézy máme k dispozici řadu moderních postupů, např. ultramikroskopii, průtokovou cytometrii, cytogenetiku a molekulární biologii, kultivační metody aj.

1.8 Klinický význam

Nerovnováha v produkci a zániku jednotlivých krevních elementů může mít za následek proliferační a/nebo cytopenické poruchy s různými klinickými obrazy (únava a dušnost u anemických stavů, krvácivé projevy u trombocytopenií, zvýšená náklonnost k infekcím u granulocytopenií nebo u poruch lymfatické složky apod.). Je zřejmé, že přesná diagnostika poruch krvetvorby je jedním ze základních faktorů podporujících náležité léčebné postupy u konkrétního pacienta. Výzkum v oblasti kmenových buněk otvírá nové možnosti léčby nejen v klinické hematologii, ale i např. v kardiologii, neurologii aj.

Literatura

1. Doulatov S, Notta F, Epperl K, et al. Revised map of the human progenitors hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymhocytic development. Nat Immunol, 2010; 11: 585–932.

2. Kaushansky K. Determinants of platelets number and regulation thrombopoiesis. Hematol Am Soc Hematol Educ Progr, 2009: 147–1524.

3. Kosagi K. Platelet production by megakarycytes: Protoplatelets theory justifies cytoplasmatic fragmentation model. Int J Hematol, 2008; 3: 255–257.

4. Lee GR, et al. Wintrobe’s Clinical Hematology. Vol. 1. 10th ed. Williams and Wilkins, 1999. 1484 s.

5. Orkin S, et al. Nathan and Oski´s Hematology of Infancy and Childhood. 7th ed. Saunders, 2008, 1872 s.

6. Pecka M. Laboratorní hematologie v přehledu. Český Těšín: FINIDR s.r.o., 2002. 160 s.

2 Fyziologie krevního srážení

Hemostáza je nezbytná pro život. Jedná se o velmi komplikovaný, přesně regulovaný proces, který dokáže zastavit krvácení pouze vmístě poranění, při neporušeném cévním řečišti naopak udržuje tekutost krve. Na hemostáze se podílí především cévy, krevní destičky a plazmatické faktory (koagulační, přirozené inhibitory afaktory fibrinolýzy). Ve skutečnosti však vtěchto systémech hrají roli všechny látky přítomné v krvi a na vnitřní straně cévy, tj. i červené krvinky, leukocyty, lipidy, další bílkoviny, minerály atd.

2.1 Cévy, cévní systém

Anglický lékař William Harvey zveřejnil vroce 1628 svůj objev uzavřeného krevního oběhu u lidí i zvířat. Krev, pumpovaná zlevé komory srdeční do aorty, se přes menší arterie a arterioly dostává až na kapilární úroveň, kde je předáván kyslík do tkání. Zkapilár pak krev protéká venulami a většími cévami, stékajícími se do horní a dolní duté žíly a do pravého srdce, odkud je plicní tepnou přiváděna do plic. Vplicních kapilárách je krev okysličována a přes plicní žíly je transportována do levého srdce, kde se cyklus uzavírá. Cévní systém má vedle své funkce cirkulační i nesmírný význam pro hemostázu. Vaskulopatie mohou zapříčiňovat krvácivé stavy, častěji však vidíme výrazný podíl vaskulární složky voblasti jak venózních, tak hlavně arteriálních hyperkoagulačních stavů (infarkty myokardu, ischemické cévní mozkové příhody, končetinové ischemie).

2.1.1 Cévní stěna

Cévy, kromě kapilár, mají třívrstvou strukturu vpodobě intimy, medie a adventicie. Intimu tvoří jednovrstvá výstelka endoteliálními buňkami, které jsou spojené polysacharidovou intracelulární matrix a obklopené bazální membránou, která je syntetizována fibroblasty i samotnými endoteliemi. Pod bazální membránou nacházíme extracelulární matrix (ECM). Hlavními buňkami ECM jsou fibroblasty ahladké svalové buňky.

Integrita cévního systému je důležitým faktorem hemostázy. Při poranění dochází kreflexnímu spazmu arteriol, venul a menších cév srelativní ischemií postižené oblasti svytvořením podmínek pro vznik primární hemostatické zátky, tvořené převážně aktivovanými trombocyty.

Subendotel se fyziologicky do kontaktu skrví dostává pouze při poranění, je velmi trombogenní a aktivuje okamžitě všechny systémy hemostázy. Nejvýznamnějšími hemostatickými složkami subendotelu jsou kolageny a tkáňový faktor (TF). Na negativně nabitých površích kolagenů dochází k aktivaci vnitřní koagulační kaskády a dále kadhezi destiček vytvořením vazby mezi kolagenem, von Willebrandovým faktorem (VWF) a receptory destiček, reprezentovanými aktivovanými glykoproteinovými komplexy GP Ib/V/IX a GP IIb/IIIa, přes GP VI může jít navíc o přímou vazbu destiček na kolagenové struktury.

2.1.2 Endotel

Velmi důležitou a metabolicky nesmírně aktivní složku tvoři systém endotelií. Jde oobrovský povrch (700–1000 m2), kde se krev stýká scévní stěnou. Na svém povrchu endotelie nesou řadu receptorů (např. trombomodulin, receptor pro protein S, fibronektin) včetně adhezivních receptorů (integrinů). Probíhá zde metabolizmus kyseliny arachidonové, syntetizují např. VWF, endotelin, tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA), tj. jsou schopny syntetizovat, hromadit a vpřípadě nutnosti exprimovat na povrch nebo sekretovat řadu jak prokoagulačních, proagregačních a vazokonstrikčních, tak i antikoagulačních, antiagregačních a vazodilatačních působků, navíc systém tPA-PAI je hlavním modulátorem fibrinolýzy. Seznam hlavních protrombotických a antitrombotických substancí je uveden vtabulce 2.1.

Neporušený, nesmáčivý endotel je nejdůležitějším fyziologickým antitrombotickým prostředkem organizmu. Endotelie dále hrají navíc důležitou roli vmodulaci lokální i celkové zánětlivé aktivity produkcí a/nebo vazbou a modulací účinku řady cytokinů.

Tab. 2.1 Endoteliální faktory modulující hemostázu

stimulace hemostázy

inhibice hemostázy

tkáňový faktor (TF)

TFPI (tissue factor pathway inhibitor)

von Willebrandův faktor (VWF)

VWF – proteáza (metabolizuje VWF)

tPA

inhibitor aktivátorů plazminogenu 1 (PAI-1)

tromboxan A2 (TXA2)

prostacyklin (PGI2)

faktor aktivující destičky(platelet activating factor – PAF)

NO(EDRF – endothelium dependent relaxing factor)

trombinový receptor(PAR – protease activated receptor)

trombomodulin (TM)

heparinázy

glykosaminoglykany (heparansulfát, dermatansulfát)

selektiny, cytoadhezivní molekuly

„down-regulation“ těchto molekul

cytokiny

antagonisté, „down-regulace“ receptorů,inhibiční cytokiny

Endotelie mohou být přeladěny do protrombotického stavu nejen přímým traumatem, nýbrž i řadou cytokinů (např. interleukinem-1, tumor nekrotizujícím faktorem – TNF), vysokou hladinou homocysteinu, oxidovanou formou LDL (low density lipoproteins) a vysokým krevním tlakem. Rozsáhlá aktivace endotelu cytokiny usepse nebo polytraumatu může vést k rozvoji syndromu diseminované intravaskulární koagulace.

Jako neoangiogenezi označujeme novotvorbu drobných cév (tvorba kolaterál při arteriálních uzávěrech, tumory indukovaná neoangiogeneze kvýživě nádorů). Souhrou koagulačních, antikoagulačních, celulárních a mnoha dalších faktorů dochází kremodelaci cév (blíže kapitola o fibrinolýze). Remodelace cév je velmi důležitým faktorem rozvoje aterosklerózy a neoangiogeneze je velmi podrobně studovaným dějem voblasti maligního bujení.

2.2 Primární hemostáza

Primární hemostáza je proces výstavby primární cévní zátky neboli agregátu krevních destiček. Jedná se o zacelení porušené integrity cévy, ať již zdůvodu jejího poranění či nutné obnovy. Právě dík destičkovému agregátu dochází kzástavě krvácení. Jakákoli porucha na úrovni systému krevních destiček vede kpozměnění či ztrátě schopnosti krvácení zastavit. Je proto nutná znalost procesu primární hemostázy, tedy výstavby destičkového agregátu ve všech jeho etapách.

Destičky jsou bezjaderná tělíska vznikající odštěpením cytoplazmy megakaryocytů vkostní dřeni. Megakaryocyty naléhají na krevní kapiláry a skrze jejich membránu se krevní destičky dostávají do krevního oběhu. Denní produkce destiček je 1,2–1,5 × 1011, počet vperiferii se pohybuje mezi 150–350 × 109/l krevního objemu. Ktomu, aby dostatečným způsobem zajišťovaly proces primární hemostázy, nedostačuje jen jejich normální počet, ale ani jejich normální funkce. Ktomu je třeba, aby destičky disponovaly odpovídajícím vybavením. Tím je především tzv. granulomer neboli granula uspořádaná většinou vcentrální části destiček. Rozlišují se dvojí granula α a δ. Obsah granulí je vyjmenován vnásledující tabulce 2.2.

Tab. 2.2 Destičková granula

denzní (δ) granula

α granula

lysozomy

ATP

destičkový faktor 4 (PF4)

galaktozidázy

ADP

β-tromboglobulin (βTG)

fukozidázy

kalcium

fibrinogen

hexozaminidázy

serotonin

faktor V

glukouronidázy

pyrofosfát

trombospondin

katepsin

P selektin (CD62)

fibronektin

glukohydrolázy

transformující růstový faktor b

destičkový růstový faktor (PDGF)

jiné

katecholaminy (nor- a adrenalin)

plazminogen aktivátoru inhibitor 1

GDP/GTP

na histidin bohatý glykoprotein

α2-makroglobulin

α2-antiplazmin

P selektin (CD62)

Destičky obsahují řadu dalších inkluzí, které zajišťují jejich energetické a životní nároky. Destička není schopna se dělit (nemá jádro) a žije pouhých 7–10 dní, přičemž je degradována a odstraňována ve slezině.

Základní funkcí krevní destičky je tedy tvorba primární cévní zátky. Ta je započata adhezí krevních destiček kreceptorům kolagenních vláken bazální membrány cévní stěny. Tato reakce je umožněna interakcí mezi zmíněným receptorem kolagenního vlákna bazální membrány a receptorem mebrány krevní destičky – glykoproteinem Ib (GP Ib) prostřednictvím von Willebrandova faktoru. Dalším aasi nejvýznamnějším krokem je agregace destiček – tedy vzájemné shlukování, které je umožněno reakcí destičkového membránového receptoru glykoproteinu IIb/IIIa(GP IIb/IIIa) sfibrinogenem a svon Willebrandovým faktorem. Zatímco je první krok, tedy adheze destiček indukována malým množstvím adenosin difosfátu (ADP), který pochází zokolní perivaskulární tkáně, pak je agregace navozena velkým množstvím endogenního ADP pocházejícího zgranul destiček. Agregaci vyvolává ale i trombin, adrenalin, kolagen, kyselina arachidonová a celá řada dalších látek, které pak lze použít i jako induktory testování agregability destiček vlaboratorních testech. Shlukování destiček není jen záležitostí membránových receptorů, ale také řady dalších změn, které jsou spojeny se změnou tvaru destiček a jejich povrchových vlastností, především jejich „lepivosti“.

Třetí významnou vlastností krevních destiček je vedle jejich adhezivní a agregační schopnosti retraktibilita, tedy schopnost stažení či smrštění destičkové zátky. Ta je dána přítomností kontraktibilních bílkovin vdestičkové membráně, které vedou ke smrštění destičkového trombu, a tím i k reparativním pochodům.

Primární hemostáza tedy vrcholí vytvořením destičkového agregátu, který podléhá smrštění a odplavení, pokud není zpevněn a fixován fibrinovou sítí vytvořenou vprocesu krevního srážení (koagulace). Nepřekvapí proto vzájemná souhra primární hemostázy a plazmatické koagulace. Hovoříme o tzv. prokoagulační schopnosti destiček, tedy schopnosti účasti destiček vkrevním srážení, která je dána destičkovým faktorem 3 (PF3). Jedná se o fosfolipidy destičkové membrány, které poskytují povrch kevzájemnému kontaktu faktorů plazmatického systému krevního srážení. Vlastní destičková membrána se skládá zdvojvrstvy fosfolipidů (PL). Vklidových destičkách jsou na povrchu sfingomyelin a fosfatidylcholin, zatímco negativní PLfosfatidylserin a fosfatidylinositol směřují do nitra destičky. Aktivace destiček vyvolá transmembránový přesun PL (tzv. flip-flop reakce), kdy se na zevní membráně exprimují negativní PL. Tyto potom poskytují katalytické povrchy pro koagulační reakce. Opačně, jak bylo již zmíněno, je také primární hemostáza významně aktivována klíčovým enzymem plazmatické koagulace – trombinem (blíže vkapitole okrevním srážení).

A nyní kjednotlivým krokům samotné výstavby destičkového agregátu. Je to proces, který trvá řádově minuty a kzástavě krvácení by mělo dojít do pěti minut.

Prvotním procesem je adheze (přilnutí) destiček ke smáčivé ploše – vtypickém případě kobnažené subendoteliální vrstvě cévní stěny. Tuto reakci zajišťují strukturální součásti destičkové membrány. Vní nacházíme fosfolipidy (cholesterol, sfingomyelin, fosfatidylcholin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol a fosfatidyletanonalim), glykolipidy a glykoproteiny (GP I–IX). Po narušení celistvosti cévní stěny dochází kodhalení jejích hlubších vrstev a zároveň stím kodhalení receptorů kolagenních vláken bazální membrány cévní stěny. Ktěmto receptorům má afinitu glykoprotein Ib vkomplexu sglykoproteinem IX (GP Ib – GP IX) destičkové membrány, který ke zmíněným receptorům kolagenu přilne. Proces je zprostředkován tzv. von Willebrandovým faktorem (VWF), který se nachází vkrevní plazmě a je součástí makromolekulárního komplexu faktoru VIII plazmatického systému krevního srážení. Adheze je provokována celou řadou stimulů – asi nejvýznamnější je účinek ADP pocházejícího zokolní – perivaskulární tkáně.

Zevní ADP také vede kuvolňování látek přítomných vdestičkových granulách, snichž je opět nejvýznamnější ADP, tentokrát destičkám vlastní, který vyvolává agregaci destiček neboli jejich vzájemné shlukování. Zde hraje roli změna tvaru apovrchových vlastností, tzv. lepivosti destiček, která je dána především expozicí – nabídnutím destičkových membránových receptorů GP IIb/IIIa. Na tento receptor se váže rovněž von Willebrandův faktor, ale také fibrinogen, které umožňují vzájemné shlukování destiček. Navození agregace nezpůsobuje jen ADP, ale i trombin, adrenalin, kolagen či kyselina arachidonová destičkové membrány a jeden zjejich konečných metabolitů tromboxan B2, jakož i všechny látky a léky, které ovlivňují zmíněné působky. S vyjmenovanými látkami je spojena řada metabolických pochodů, znichž ktěm významnějším patří metabolizmus cyklických endoperoxidů, tedy látek vznikajících vmetabolizmu kyseliny arachidonové (obr. 2.1) a dále také energetický metabolizmus makroergních fosfátových vazeb, především kolísání množství cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP).

Obr. 2.1 Cesty aktivace destiček

Důsledkem ovlivnění některých zmíněných pochodů je změna vobsahu kalciových iontů destičky, které hrají roli při vzniku tubulárních systémů a degranulaci trombocytu. Vovlivnění procesu agregace tromboxanem či měnícím se obsahem cAMP hraje roli celá řada látek, ať již fyziologicky regulujících tento proces nebo používaných léčebně. Sem patří především inhibitory cyklooxygenázy I (COXI) vcyklu tvorby prostaglandinů a dále inhibitory fosfodiesterázy aagonisté adenylátcyklázy v ovlivnění tvorby cAMP.

Vprocesu retrakce hraje roli kontraktilní (stažlivý) systém sestávající zdenzního mikrotubulárního systému a cirkumferenčních mikrofilament, které normálně udržují diskoidní tvar destiček. Nejdůležitějšími součástmi systému jsou aktin, myozin a regulační protein kalmodulin.

2.3 Systém plazmatických faktorů

Proteiny plazmy, které se přímo účastní krevního srážení, označujeme jako plazmatické faktory. Podle jejich hlavního místa účinku je dělíme na faktory koagulační, přirozené inhibitory krevního srážení a faktory fibrinolýzy.

Z biochemického hlediska se jedná o (1) enzymy, které kolují vkrvi jako neaktivní proenzymy (zymogeny), jsou serinové proteázy – faktory (F) II, VII, IX, X, XI, XII; prekalikrein (PKa), plazminogen (plg), tkáňový a urokinázový aktivátor plazminogenu (tPA, uPA); protein C (PC) a transglutamináza FXIII. Dále jsou to (2) kofaktory (látky, které urychlují enzymatické reakce), a to jednak plazmatické: FV, VIII, vysokomolekulární kininogen (HMWK), protein S (PS) a protein Z (PZ), jednak buněčné: tkáňový faktor (TF, dříve tkáňový tromboplastin, faktor III), trombomodulin (TM), endoteliální receptor pro protein C (EPCR). (3) Fibrinogen (fbg) je substrát trombinu, jehož účinkem se mění na fibrin (tab. 2.3). (4) Mezi adhezivní plazmatické proteiny patří von Willebrandův faktor, fibronektin, vitronektin a další. (5) Regulační proteiny (= přirozené inhibitory krevního srážení) se dělí na inhibitory ze skupiny serpinů – antitrombin (AT), heparin kofaktor II (HCII), C1 inhibitor (C1INH), α2-antiplazmin, inhibitor aktivátoru plazminogenu (PAI-1, PAI-2), inhibitor aktivovaného proteinu C (PCI = PAI-3), proteázové inhibitory Kunitzova typu – TFPI, metaloproteinázy (ADAMTS13, TAFI, MMP) asamostatnou skupinu tvoří α2-makroglobulin (α2MG). Podle účinku sem patří i serinová proteáza protein C a kofaktory protein Sa Z (tab. 2.5).

Krevního srážení se dále účastní (6) fosfolipidy (PL), estery glycerolu a kyseliny fosforečné, které jsou integrální součástí buněčných membrán. Negativní PL jsou především fosfatidylserin, kneutrálním patří fosfatidyletanolamin. Hlavní funkce PL vorganizmu je účast na vzniku a přeměně membrán, transport tuku vorganizmu a poskytování negativně nabitých povrchů pro koagulační reakce. Nezbytné jsou i(7) ionty minerálů – vápníkové (Ca2+), hořčíku, zinku a další. Vápníkové ionty jsou potřebné při celé řadě reakcí ve všech systémech hemostázy, jsou nezbytné ve všech reakcích faktorů závislých na vitaminu K. Vyvázáním vápníkových iontů dosáhneme nesrážlivé krve.

2.3.1 Systém koagulačních faktorů

Zástava krvácení je velmi komplexní děj, na kterém se podílí celá řada plazmatických faktorů.

2.3.1.1 Koagulační faktory

■ Proenzymy – enzymy

Svýjimkou FXIII a kofaktorů FV a FVIII, jsou koagulační faktory serinové proteázy, tj. mají vaktivním místě enzymu tzv. katalytickou triádu (aminokyseliny serin, histidin a kyselina aspartamová).

Faktory závislé na vitaminu K

Tzv. Kdependentní, potřebují ke své funkci vitamin K, který je nezbytný pro karboxylaci gamaglutámového zbytku. Bez karboxylace není faktor schopen vazby na Ca2+ a PL. Na vitaminu K závislé faktory jsou při nedostatku vitaminu sice tvořeny, ale nejsou koagulačně aktivní (tzv. PIVKA formy) a zůstávají na úrovni prekurzorů. Zbytky glutaminu neumožňují proteinu vazbu na negativně nabité fosfolipidy. Vhemostáze se uplatňují FII, FVII, FIX, FX, protein C, Sa Z.

Základní charakteristiky faktorů a vztahy mezi nimi jsou uvedeny v tabulkách 2.3 a 2.4.

Tab. 2.3 Plazmatické hemostatické faktory

název

značení/

zkratka

syntéza

koncentrace

poločas/h

mol. hmot.

kDa

chrom.

min.akt.

%

fibrinogen

protrombin

proakcelerin

prokonvertin

antihemofilický globulin

antihemofilický faktor

Stuartův-Prowerové faktor

Rosenthalův faktor

Hagemanův faktor

faktor stabilizující fibrin

prekalikrein

vysokomolekulární kininogen

FI

FII

FV

FVII

FVIII

FIX

FX

FXI

FXII

FXIII

PKa

HMWK

játra

játra (vitamin K)

játra, mgk

játra (vitamin K)

játra a jiné

játra (vitamin K)

játra (vitamin K)

játra

játra

játra (B), mgk (A)

játra

játra?

2,0–4,0 g/l

0,1–0,2 g/l

8–14 μg/ml

2–5 μg/ml

0,1 μg/ml

3–4 μg/ml

6– 8 μg/ml

5–7 μg/ml

30–40 μg/ml

10–20 μg/ml

35–50 μg/ml

60–80 μg/ml

72–120

60–96

8–24

4–6

8–12

18–30

30–48

48–60

50–70

72–160

30–40

120–150

340

72

330

50

330

56

56

160

80

320

90

120

4

11

1

13

X

X

13

4

5

1(B), 6(A)

4

3

0,6 g/l

40

10–15

10

20–30

20–30

20

15–20

20–30

1–2

von Willebrandův faktor

proteáza aktivující FVII

tkáňový faktor

VWF

FSAP

TF

endotelové buňky

játra

subendotel, fibroblasty

10 μg/ml

12 µg/ml

6

220

64 kDa

45 kD

12

10

1

plazminogen

tkáňový plazminogen aktivátor

urokináza

plg

tPA

uPA

játra, eozinofily

cévní endotel, monocyty, mgk

ledviny

200 μg/ml

0,005 μg/ml

0,008 μg/ml

48–60

5 min

6 min

90

68

54

6

8

10

Tab. 2.4 Vztahy mezi koagulačními faktory

faktor

aktivován/štěpen

funkce/aktivuje

Ca2+

degradován

Fbg

trombin, plazmin

krevní koagulum,převod signálů,aktivace trombocytů

–

plazmin

II

protrombináza(Xa+ Va+PL+Ca2+)

Fbg, FV, VIII, XI, XIII,trombocyty, TAFI, protein C

ano

AT, HCII, α2MG

V

trombin, Xa

kofaktor při aktivaci FII

–

trombin, plazmin

VII

TF, TF/VII, FVIIa, FSAP, Xa, XIa, IXa

FX, IX

ano

pouze inhibice komplexuTF/VIIa – TFPI, AT

VIII

trombin, Xa

kofaktor při aktivaci FX

–

trombin, plazmin

IX

FXIa, VIIa

FX

ano

AT

X

TF/VIIa, tenáza(IXa+VIIIa+PL+Ca2+)

FII, V, VIII,

ano

AT, α2MG

XI

TF/VIIa, IIa, XIIa

IX, HMWK, XII,Aα řetězec fbg, plg

–

nexin proteáz II, AT, C1INH, α1AT

XII

Ka, trypsin, plazmin, XIa; povrchy

XI, HMWK, PKa

–

C1INH, AT, PAI-1

XIII

trombin

stabilizuje fibrin

ano

FSAP

FVII, uPA

ano

PAI, α2AP

Faktor II, proenzym protrombin se váže pomocí Ca2+ na negativně nabité PL, kde je štěpen protrombinázou na aktivní formu αtrombin. V koagulaci hraje trombin klíčovou roli, podle potřeby působí jak prokoagulačně, tak antikoagulačně. Vhemostáze trombin vedle štěpení fibrinogenu katalyzuje vpodstatě tři skupiny reakcí, které slouží kregulaci tvorby koagula. První skupina zahrnuje aktivaci buněk (např. trombocyty), které poskytují povrchy pro koagulační reakce. Druhá skupina reakcí slouží kposílení probíhající koagulace a zpevnění vznikajícího koagula (aktivace FV, FVIII, FXIII, FXI). Poslední typ reakcí je naopak nutný kzabránění nadměrnému srážení. Jedná se o reakce vedoucí kinaktivaci kofaktorů krevního srážení (inhibice FVa a FVIIIa cestou aktivovaného proteinu C – APC, přímé štěpení kofaktorů vyšším množstvím trombinu). Do systémů fibrinolýzy trombin také zasahuje aktivací TAFI.

Vznik trombinu vmístě poranění je explozivní, autoamplifikující se, současně ale vysoce regulovaný proces, který hraje důležitou roli nejen vprocesech hemostázy atrombózy, ale i zánětlivé a proliferační odpovědi organizmu.

Trombin má vedle enzymatické funkce i funkce neenzymatické – reaguje sfibrinem, váže se na trombomodulin (TM), GP Ib formou nekovalentní vazby, aktivuje PAR receptory.

Trombin moduluje řadu prozánětlivých procesů cestou regulace aktivace trombocytů, exprese leukocytárních adhezivních molekul, chemotaxe leukocytů, produkce protrombotických faktorů endoteliálních buněk. Dále potencuje proliferaci endoteliálních buněk, fibroblastů, zvyšuje uvolňování jiných cytokinů a růstových faktorů. Na endotelu indukuje např. sekreci von Willebrandova faktoru a produkci cytokinů.

Enzymatická aktivita trombinu je kontrolována přirozenými inhibitory, především α2-makroglobulinem, dále serpiny AT, heparin kofaktorem II (jako kofaktor působí glykosaminoglykany – GAG).

PAR (protease-activated receptors) přenášejí signály trombinu. Patří do skupiny receptorů spojených se sedmou transmembránovou doménou Gproteinu (největší skupina receptorů u savců). Tyto receptory jsou schopné přeměnit extracelulárně probíhající proteolytické štěpení v transmembránový signál a tím zprostředkovávají např. trombinem indukovanou vazodilataci, zvyšují cévní permeabilitu a adhezi neutrofily-endotel.

Faktor VII je faktor s velmi krátkým biologickým poločasem, na druhé straně poločas aktivované formy (2,5 hodiny) je výrazně delší než ostatních aktivních faktorů. Je syntetizován vjátrech, lokálně jsou jeho důležitým zdrojem i aktivované monocyty/makrofágy. Faktor VII má i sám proteolytickou aktivitu a je schopen štěpit faktor X. Není dosud popsán inhibitor samotného FVIIa, pouze komplexu TF/FVIIa (TFPI a AT). Aktivita FVII se zvyšuje svěkem a vtěhotenství. Prokoagulační aktivita FVII pozitivně koreluje spříjmem tuků vpotravě a hladinou sérových lipidů, hlavně triglyceridů.

Aktivní forma faktoru IX FIXa je enzymaticky aktivní vkomplexu zvaném tenáza (FIXa+ FVIIIa + PL (fosfatidylserin)+ Ca2+), která aktivuje FX na Xa. FVIIIa je kofaktorem této reakce. FIXa je schopen také zpětně aktivovat za přítomnosti Ca2+ afosfolipidů FVII na VIIa.

Faktor X je ve své aktivní formě Xa in vitro nejmocnější aktivátor FVII. Reakce je významně rychlejší, pokud je FVII navázán na TF. Mimoto FXa vpřítomnosti PL a Ca2+ aktivuje také FV na Va (i když štěpení je odlišné), je schopen vazby na TM atak aktivace proteinu C. Inaktivace FXa antitrombinem je vpřítomnosti FV, Ca2+ aPL výrazně snížená. Při nedostatečném množství trombinu může FXa tento enzym nahradit, např. vzačátcích krevního srážení.

Faktory citlivé ktrombinu

Faktor XIII, tzv. fibrin stabilizující faktor, je poslední faktor koagulační kaskády – transglutamináza, který je jediným koagulačním enzymem scysteinem vaktivním místě. Skládá se ze dvou párů polypeptidů (A a B řetězec). Apodjednotka (podj.) je homologní sostatními transglutaminázami, které zajišťují stabilizaci tkání kovalentně vázanými proteiny. Bpodj. hraje důležitou roli vregulaci aktivace FXIII. Podjednotky nalézáme vplazmě i samostatně. Apodj. je tvořena megakaryocyty aprogenitorovými buňkami mononukleárů a je také přítomna vcelé řadě tkání (děloha, placenta, prostata, trombocyty, makrofágy) jako a´-dimer. Bpodj. je tvořena vjátrech a vplazmě ji nalézáme buď jako tetramer spolu sApodj., nebo samostatně jako dimer. Struktura FXIII se liší vzávislosti na místě tvorby. Vdestičkách cytoplazmy je FXIII tvořený pouze dvěma A podjednotkami, je uvolňována při aktivaci trombocytů. Vplazmě cirkuluje FXIII společně sfibrinogenem a je aktivován trombinem za přítomnosti Ca2+. Po tvorbě fibrinu zůstává Bpodj. vséru, zatímco Ařetězec je vázán ve fibrinové sraženině.

FXIIIa katalyzuje formaci intermolekulárních vazeb mezi různými proteiny jako např. fibrinovými monomery, α2-antiplazminem (α2AP), fibronektinem, kolagenem. Působením na rozpustný fibrin mění nekovalentní vazby na pevné vazby kovalentní (tzv. D-dimery). Navázáním α2AP na fibrin chrání koagulum před fibrinolýzou. FXIIIa hraje důležitou úlohu nejen vhemostáze, ale i hojení ran a např. udržení těhotenství.

Do této skupiny lze také zařadit FV, FVIII (viz kofaktory), FXI (viz faktory fáze kontaktu) a další.

Faktory fáze kontaktu

Faktor XII je aktivován kontaktem např. se subendotelovými strukturami při poranění (autoaktivace nebo tzv. aktivace pevnou fází) nebo proteázami (enzymatická fáze). Aktivační povrch může být i sklo, kaolin, elagová kyselina, endotoxiny a jiné. FXIIa aktivuje kromě FXI i prekalikrein a HMWK. Faktor XII zasahuje vedle koagulace především do systémů imunologických. Zvýšená hladina je u žen vtěhotenství a po menopauze.

Plazmatický FXI cirkuluje vplazmě vkomplexu sHMWK a je odlišný od trombocytárního FXI. Je aktivován limitovanou proteolýzou FXIIa (za přítomnosti HMWK), FVIIa a trombinem vpřítomnosti negativně nabitých částic. V přítomnosti Ca2+ probíhá aktivace rychleji. FXIa i při aktivaci FIX zůstává navázán na HMWK, který jednak stabilizuje vazbu FXIa na povrchy, jednak brání štěpení FXIa. FXIa je schopen také štěpit HMWK, aktivuje FXII, může štěpit Aα řetězec fibrinogenu, plazminogen na plazmin. Specifickým inhibitorem FXIa je nexin proteáz II (reakce je urychlována heparinem a Zn2+). FXIa je inhibován také antitrombinem, C1INH aα1-antitrypsinem.

Prekalikrein (PKa) je gamaglobulin, vplazmě cirkuluje navázán na HMWK. PKa je aktivován faktorem XIIa nebo XIIf na αkalikrein (Ka). Mezi faktory fáze kontaktu je zařazován i vysokomolekulární kininogen (viz kofaktory).

Jiné

FSAP – proteáza aktivující FVII (factor VII-activating protease) je nově identifikovaná serinová protéza, která je silným aktivátorem FVII. Aktivuje také jednořetězovou uPA. Aktivní FSAP je závislá na Ca2+ a je inhibována PAI-1 a α2AP.

■ Kofaktory

Plazmatické kofaktory

Kininogeny jsou plazmatické proteiny, ze kterých se uvolňují vazoaktivní peptidy (bradykinin). Vplazmě se nalézají ve formě vysokomolekulární (HMWK) a nízkomolekulární (LK). HMWK působí jako kofaktor aktivace na povrch navázaného FXII kalikreinem. HMWK se váže na aktivované trombocyty, na neutrofily a buňky endotelu. Těžký řetězec HMWK i LK má schopnost inhibovat cysteinové proteázy (kalpain, katepsin L).

Faktor Vje homologní sFVIII. Komplex kofaktorů sCa2+ a PL významně zvyšují rychlost aktivace faktorů. FV se nalézá v plazmě a α granulách krevních destiček (asi 20%). FV je aktivován limitovanou proteolýzou trombinem a FXa (vyžaduje přítomnost PL) za přítomnosti Ca2+. FV může být aktivován i plazminem (bez Ca2+), elastázou neutrofilů, jedem Russelovy zmije. Inhibitorem FVa je aktivovaný protein C (APC), štěpen může být iplazminem. FVa navázaný na FXa a protrombin je chráněn před účinkem plazminu.

Faktor VIII cirkuluje vplazmě navázán na von Willebrandův faktor (VWF). Zvazby na VWF se uvolňuje kontaktem sPL nebotrombinem. Působením trombinu dochází klimitovanému štěpení FVIII. Vpřítomnosti PL může být FVIII štěpen i faktorem Xa. Dlouhé působení většího množství trombinu naopak FVIIIa (stejně jako FVa) inaktivuje, dalším inhibitorem je APC za přítomnosti PL, Ca2+, FV aproteinu S. FVIII je syntetizován především vjátrech, dále potom např. ve slezině, uzlinách, slinivce, ledvinách. Jako u ostatních proteinů akutní fáze se hladina FVIII zvyšuje při zánětech, ale i chronických infekcích a při stresu.

Vkoagulační kaskádě působí faktor VIIIa vkomplexu sfaktorem IXa, PL a Ca2+ zvaném „tenáza“. Na VWF je FVIII vázán nekovalentní vazbou a poměr hladiny VWF a FVIII zůstává vplazmě zachován i při změnách hladiny VWF. FVIII vkomplexu sVWF je chráněn před biologickým štěpením APC a faktorem Xa. VWF dále lokalizuje FVIII v místě poranění a má efekt kofaktoru při proteolytické aktivaci FVIII trombinem.

Buněčné kofaktory

Tkáňový faktor (TF) je syntetizován plně funkční, nepotřebuje kplnění své funkce proteolytickou modifikaci. Jedná se o integrální transmembránový glykoprotein, který patří do skupiny cytokinových receptorů. Jeho bílkovinná složka je úzce spojena sPL a tato vazba je nutná pro prokoagulační aktivitu TF. TF působí jako buněčný receptor pro FVII a tvorba komplexu s FVII nebo FVIIa zahajuje koagulaci. Tvorba komplexu vyžadujepřítomnost Ca2+. Současně TF zvyšuje afinitu FVIIa kjeho substrátům.

TF se nalézá v organizmu na buňkách, které se fyziologicky nedostanou do kontaktu skrví, tj. běžně není přítomen na cévních endoteliích, krevních elementech ani jeho část necirkuluje vplazmě jako tzv. solubilní TF. Tkáňový faktor se do kontaktu skrví dostává v případě porušení nebo poranění cévy, ale může být exprimován i při intaktní cévě, např. při stimulaci endotoxiny, cytokiny (IL-1, TNF) a trombinem, a to jak na endotelu, tak i na monocytech. Aktivita TF na endotelu může být indukována také imunitními komplexy a lipopolysacharidy.

Mezi buněčné kofaktory také patří trombomodulin, EPCR, PZ (blíže vkapitole osystému přirozených inhibitorů).

■ Fibrinogen (faktor I)

Fibrinogen je fibrilární protein, přítomný jak vplazmě, tak vα granulách trombocytů. Molekula je složena ze tří párů polypeptidových řetězců (Aα, Bβ a γ). Důležitou úlohu vudržení struktury a stability fibrinogenu hrají Ca2+. Fibrinogen je štěpen buď trombinem na fibrin (obr. 2.3), nebo plazminem na fibrinogen degradační produkty (obr. 2.4 a systémy fibrinolýzy). Kromě toho může být fibrinogen štěpen tzv. trombinu podobnými enzymy (např. hadí jed reptiláza). Jako protein akutní fáze se zvyšuje při zátěžích, jako je poranění, záněty, těhotenství.

Fibrin vzniká působením trombinu na fibrinogen. Je důležitý pro vazbu krevních destiček mezi sebou a přispívá kjejich vazbě na cévní stěnu, která je zprostředkována destičkovými GP a dalšími adhezivními proteiny.

■ Adhezivní proteiny

Adhezivní proteiny umožňují kontakt buněk mezi sebou navzájem a mezi buňkou aextracelulární matrix (ECM). Vhemostáze je nejdůležitější von Willebrandův faktor. Je to adhezivní protein, který je syntetizován výhradně vmegakaryocytech aendoteliálních buňkách. Je přítomen vα granulách destiček, plazmě a subendotelu. Vendotelu ho můžeme prokázat v tzv. Weibelových-Paladeho tělískách. VWF patří knejvětším molekulám v plazmě, tvoří tzv. multimery (VWFm). Nejmenší multimery jsou dimery, největší obsahují i 50–100 podjednotek. Extrémně velké VWFm jsou přítomny vendoteliálních buňkách, subendotelu a destičkách a pouze občas se objeví vkrvi. Jsou nejefektivnější vprocesu adheze destiček a agregace. Malé multimery jsou uvolňovány zendotelu bez stimulace. Každá podjednotka VWF multimeru je schopna vázat jeden heterodimer FVIII. VWF je ihned po uvolnění na buněčném povrchu štěpen ADAMTS13, dále je citlivý na proteolýzu plazminem.

Výrazem koagulační aktivity VWF je aktivita „ristocetinového kofaktoru“ –VWF:RCo, schopnost vazby na kolagen (collagen binding activity – VWF:CBA), případně agregace destiček indukovaná ristocetinem (RIPA). VWF:Ag je zkratka pro antigen. Dřívější označení AHF-like (antihemofilickému globulinu podobný) se již neužívá.

VWF hraje klíčovou roli vprimární hemostáze, formaci trombu a koagulaci. Má dvě hlavní funkce: vprimární hemostáze a vkoagulaci.

Vprimární hemostáze zprostředkovává adhezi trombocytů (kontakt destička-cévní stěna) a agregaci trombocytů. Pro tyto funkce je nutná interakce VWF s destičkovým GP Ib (adheze) a následně s GP IIb/IIIa. Tato vazba vede krozprostření trombocytů s následnou ireverzibilní destičkovou adhezí a agregací. Tato funkce je závislá na správné struktuře VWFm. Pouze velké multimery jsou schopny plnit funkci vprimární hemostáze.

Funkce VWF vkoagulaci není závislá na velikosti multimerů. VWF jako nosič váže a stabilizuje FVIII. Zabraňuje inaktivaci FVIII aktivovaným proteinem C nebo FXa a lokalizuje FVIII vmístě tvorby sraženiny.

HladinaVWF v plazmě (stejně jako FVIII)závisí nakrevní skupině. Nejnižší hladiny mají lidé se skupinou 0 a nejvyšší hladiny byly zjištěny u nositelů skupiny AB. VWFpatří k proteinům, které nesou antigenyAB0 krevního systému.

Dalšími adhezivními proteiny jsou např. fibronektin (FN – také řazen mezi strukturální proteiny), který je přítomen vplazmě, subendotelu, α granulách destiček aECM. Zodpovídá za adhezi buněk, morfologii, migraci, diferenciaci, fagocytózu ahemostázu. Zprostředkovává adhezi destiček a rozprostření jak vklidových podmínkách, tak za cirkulace. FN podporuje adhezi trombocytů kostatním povrchům jako kolagenu typu I a III. Vitronektin (VN) je přítomen vcirkulaci a vřadě tkání. VN má ústřední regulační funkci vsystému komplementu, koagulace a fibrinolýzy.

2.3.1.2 Vlastní proces koagulace

Cílem koagulace je zástava krvácení, tj. generace trombinu a vytvoření pevného fibrinového vlákna. Tohoto je dosaženo postupnou, přesně koordinovanou a regulovanou kaskádovitou enzymatickou reakcí. Při ní jsou faktory, které jsou v krvi přítomny jako neaktivní formy – proenzymy, štěpeny na aktivní formu. Označujeme je jako koagulační faktory a značíme „F“ a římskou číslicí, aktivované formy (vlastní enzymy) s malým „a“ (např. FII se aktivuje na FIIa).

Podle teorie publikované v roce 1964 se koagulační kaskáda podle způsobu aktivace dělí na zevní a vnitřní systém, který se spojuje při aktivaci FX na Xa a společně generuje trombin (obr. 2.2). K aktivaci zevního systému je potřeba tkáňový faktor, který se uvolňuje např. v případě poranění, k aktivaci vnitřní cesty dochází kontaktem FXII a FXI s aktivním povrchem (také nazývaná fáze kontaktu), fyziologicky kolagenem obnaženým po poranění. Předpokládalo se, že důležitější je tzv. vnitřní cesta. Vdevadesátých letech 20. století bylo prokázáno, že primární je zevní cesta avnitřní cesta je vedlejší a větší význam mají faktory kontaktu v aktivaci systému kalikreinu, kininu a komplementu. Navíc je zřejmé, že koagulační komplexy se tvoří pouze na površích buněk (trombocyty, subendotel, fibroblasty a další).

Obr. 2.2 Koagulační kaskáda (HMWK – vysokomolekulární kininogen, PKa – prekalikrein, PL – fosfolipidy, TF – tkáňový faktor, Ca2+ – vápníkové ionty)

K aktivaci koagulace dochází poté, co se FVII, který je běžně přítomný ve stopových množstvíchkrvi, dostane do kontaktu sTF (obr. 2.2). Komplex TF/FVII, případně FVIIa přímo aktivuje FX na Xa (za přítomnosti Ca2+). Komplex TF/FVIIa dále aktivuje i FIX a zasahuje tak i do vnitřní cesty. FXa tedy vzniká jednak přímo aktivací TF/FVIIa, jednak vnitřní cestou komplexem zvaným tenáza: FIXa/VIIIa/PL/Ca2+. Po aktivaci FXa následuje tvorba komplexu zvaného protrombináza. Tato je fyziologickým aktivátorem protrombinu a je složena z FXa, kofaktoru FVa navázaného na povrch (PL) za přítomnosti Ca2+. Tento komplex štěpí neaktivní protrombin na αtrombin a fragmenty protrombinu 1+2 (F1+2). Trombin aktivovaný faktorem Xa, který byl štěpen komplexem TF/FVIIa je důležitý pro aktivaci krevních destiček, včetně uvolnění FVa, uvolňuje FVIII zvazby na VWF, aktivuje FXI. Zatímco trombin vzniklý cestou aktivace faktoru X tenázou štěpí fibrinogen (obr. 2.3).

Obr. 2.3 Formace fibrinu (Aα, Bβ, γ – řetězce fibrinogenu)

Trombin je jediným koagulačním enzymem, který je schopen štěpit fibrinogen na fibrin. Působením trombinu (obr. 2.3 a 2.4) dochází k odštěpení fibrinopeptiduA a B (FPA, FPB) zřetězce Aα a Bβ fibrinogenu. Tím se obnaží vazebná místa vcentrální E doméně a vznikají fibrinové monomery (FM). Tyto spontánně polymerizují na rozpustný fibrin.

Obr. 2.4 Štěpení fibrinogenu a fibrinu trombinem a plazminem

Polymerizace probíhá postupně, jako první se tvoří vlákna jednotlivých konců FM (vazba Ddomén). Následně vazebná místa E domény reagují skomplementárními místy γ řetězce Ddomény přilehlých FM (polymerizace „side to side“, tj. strana ke straně). Tato nekovalentní interakce probíhá vtzv. E-D kontaktním místě. Prvotní vlákna bývají nazývána protofibrily. Působením FXIIIa na rozpustný fibrin dochází ke vzniku příčných vazeb mezi jednotlivými vlákny vmístě Ddomén a vytvoří se trojrozměrná síť stabilního, nerozpustného fibrinu.

Fibrin zpevní primární destičkové koagulum a vzniká pevná krevní sraženina. Tím je vlastní proces krevního srážení uzavřen.

2.3.2 Systém přirozených inhibitorů

Fyziologicky je i v klidovém stavu v krvi přítomno malé množství aktivních koagulačních faktorů včetně trombinu. K udržení rovnovážného stavu je nutná důsledná regulace, tj. množství generovaných enzymů se musí rovnat množství, které je inaktivováno – toto platí pro FXa a FIIa, vpřípadě FVII je zřejmě hlavním regulačním mechanizmem přítomnost či nepřítomnost TF.

Velmi důležitou roli v procesech krevního srážení hrají tzv. regulační proteiny, tj. přirozené inhibitory, jež patří k základním plazmatickým faktorům. V organizmu slouží jako jeden ze zpětnovazebných mechanizmů k zabránění nekontrolovaného srážení krve a tím k udržení koagulační rovnováhy (tab. 2.5 a obr. 2.5). Vedle inhibitorů vregulaci krevního srážení spolupůsobí i samotné koagulační faktory (trombin, FV, FXa).

Tab. 2.5 Přirozené inhibitory

název

zkratka

místo tvorby

koncentrace

poločas

hod.

mol. hm.

kDa

chromozom

typ

cílový

enzym/

bílkovina

antitrombin

heparin kofaktor II

C1-inhibitor

α1-antitrypsin(proteázový inhibitor)

α2-antiplazmin

inhibitor aktivátoru plg-1

inhibitor aktivátoru plg-2

AT

HCII

C1INH

α1AT

α2AP

PAI-1

PAI-2

játra, endotel

endotel

játra

trombocyty, mgk

játra

endotel, tuková tkáň, trombocyty

placenta

0,10–0,25 g/l

8,0–9,0 μg/ml

0,18–0,22 g/l

1,3–2,5 g/l

0,05–0,07 g/l

0,01 μg/l

< 0,005

45–70

–

38–40

90–96

60

–

–

62

65

105

55

67

52

IC – 43; EC – 60

1

22

11

14

18

7

18

serpin

serpin

serpin

serpin

serpin

serpin

serpin

IIa, Xa

IIa, Xa

XIIa, Ka

Xa, APC

plazmin

tPA, uPA

uPA, tPA

inhibitor cesty

tkáňového faktoru

TFPI

endotel

0,1 mg/ml

–

33

2

kunin

Xa, TF/VIIa

protein C

protein S

trombomodulin

inhibitor aktivovanéhoproteinu C

PC

PS

TM

PCI

játra (vitamin K)

játra (vitamin K)

endotel

játra

4,0–5,0 μg/ml

0,02–0,04 g/l

–

3,0–5,0 μg/ml

5–6

60

–

–

62

69

75–105

57

2

3

20

14

serinováproteáza

kofaktor

kofaktor

serpin

Va, VIIIa

Xa, FVIII

IIa, (Xa)

APC, Ka

α2-makroglobulin

α 2MG

trombocyty, endotelové buňky, makrofágy

2,0–2,5 g/l

200–250

725

12

–

Ka, plazmin, IIa

protein Z

inhibitor proteáz závislý na PZ

ADAMTS13

inhibitor fibrinolýzyaktivovaný trombinem

PZ

ZPI

TAFI

játra (vitamin K)

játra

játra, endotel,

trombocyty

játra

1,16–2,9 ng/ml

1,0–1,6 μg/ml

1 μg/ml

2,5 μg/ml

48–72

48–72

62

72

180–200

60

13

14

9

13

kofaktor

serpin

metaloproteináza

metaloproteináza

komplex sPZI

FXa, FXIa

VWF

Obr. 2.5 Působení přirozených inhibitorů vkoagulační kaskádě (APC – aktivovaný protein C, AT – antitrombin, C1INH – C1 inhibitor, HMWK – vysokomolekulární kininogen, PC – protein C, PKa – prekalikrein, PL – fosfolipidy, PS – protein S, TF – tkáňový faktor, TFPI – inhibitor zevní cesty tkáňového faktoru, TM – trombomodulin)

Na začátku našeho století byl pro látky, které inhibovaly trombin, použit název antitrombiny. A byly označovány I–VI. Název zůstal zachován pouze v názvu nejmocnějšího inhibitoru serinových proteáz antitrombinu (dříve antitrombin III – římská číslice se nemusí používat).

2.3.2.1 Serpiny

Inhibitory serinových proteáz serpiny jsou většinou nespecifické inhibitory. Komplex serpin-serinová proteáza je po uvolnění do cirkulace vychytáván vjátrech serpinovými receptory. Jsou důležitým regulačním faktorem nejen vsystémech hemostázy. Vroce 2006 byla vydána klasifikace serpinů (tab. 2.6).

Tab. 2.6 Nová klasifikace serpinů (Law et al., 2006)

název

klasifikace

cílová proteáza

kofaktory

AT

SERPINC1

trombin, Xa, IXa

GAG

HCII

SERPIND1

trombin

GAG

ZPI

SERPINA10

Xa, IXa

Ca2+, PL, PZ

PCI

SERPINA5

trombin, APC, tPA

heparin, TM

α1PI

SERPINA1

trombin, APC

–

α2AP

SERPINF2

plazmin

–

PAI-1

SERPINE1

tPA, uPA

–

Antitrombin (AT) (tab. 2.5) je protein akutní fáze, jeho poločas vplazmě se za patologických stavů výrazně zkracuje z běžných 45–60 hodin i na méně než tři. AT je přítomný i extravaskulárně a je splazmatickým vrovnováze. Regulace syntézy AT je navázána na regulaci syntézy fibrinogenu. Při štěpení fibrinogenupři aktivaci koagulace klesá i antitrombin. Proto štěpení fibrinogenu dává signál i kdalší syntéze AT.

AT působí primárně na endotelu a má širokou antiproteázovou aktivitu, je primárním inhibitorem trombinu. Tvoří ireverzibilní komplex nejen strombinem, ale i sdalšími serinovými proteázami. Sám je schopen pomalé inhibice FIIa a Xa, za přítomnosti heparinu jako kofaktoru inhibuje i FIXa a v různé míře serinové proteázy vůbec. Není schopen inhibovat samotný FVIIa, ale je důležitým inhibitorem komplexu TF/FVIIa. AT zasahuje i do regulace systému komplementu a působí i protizánětlivě.

Heparin kofaktor II (HCII) je fyziologický, specifický inhibitor trombinu. Je přítomen především na cévním endotelu a fyziologicky má zřejmě pouze lokální význam. Jeho účinek je urychlován heparinem, hlavně však dermatan sulfátem, který také patří do GAG.

C1inhibitor (C1INH) je nejmocnějším inhibitorem faktorů kontaktu a zasahuje především do systému komplementu (C1s), dále je schopen inhibovat i plazmin. C1INH je syntetizován v játrech. Byl zjištěn kromě v plazmě i v α granulách trombocytů a je uvolňován v průběhu aktivace destiček.

Inhibitor aktivovaného PC (PCI) je přítomen i vřadě tělních tekutin (sliny, mléko, slzy, sperma). Ukázalo se, že je identický sPAI-3. Po vazbě na heparin inhibuje řadu proteáz včetně APC, IIa, IIa v komplexu s TM, FXa, tPA, uPA. Má zřejmě jak prokoagulační tak antikoagulační vlastnosti v závislosti na tom, kterou proteázu inhibuje a který kofaktor je přítomen.

Proteinázový inhibitor závislý na proteinu Z (ZPI) je serpin produkovaný játry. V přítomnosti PZ, Ca2+ a PL je rychlým inhibitorem FXa, bez kofaktorů ZPI inhibuje FXIa a tato funkce je cca 2× urychlována heparinem. Předpokládá se, že jeho hlavní funkcí je tlumit koagulační odpověď před vytvořením protrombinázy.

Protein Z(PZ) Kdependentní GP, vplazmě cirkuluje vkomplexu seZPI. PZ působí jako kofaktor při inhibici FXa cestou PZI na PL. Při podávání kumarinů klesá koncentrace velmi rychle a na rozdíl od ostatních Kdependentních faktorů se snižuje i antigen PZ.

2.3.2.2 Systém proteinu C

Je to přirozená antikoagulační cesta, jejímž cílem je štěpení faktorů Vaa VIIIa a tím regulace tvorby sraženiny. Systém tvoříprotein C(PC), protein S (PS), trombomodulin (TM), inhibitor aktivovaného proteinu C a receptor pro protein C na endotelu (EPCR).

Aktivace PC probíhá na povrchu cévních endotelií (obr. 2.6 v příloze). Jako kofaktor této reakce působí specifický endoteliální receptor trombinu trombomodulin. Trombin vázaný na TM již není koagulačně aktivní. Komplex trombin-trombomodulin za přítomnosti Ca2+ aktivuje PC. Aktivovaný protein C (APC) za přítomnosti kofaktoru PS inaktivuje FVa, kofaktorem inaktivace FVIIIa je vedle PSiFV. Štěpení obou kofaktorů je inhibováno ceruloplazminem. APC zasahuje rovněž do systému fibrinolýzy – uvolňuje tPA z vazby na PAI-1 (tvoří komplex sPAI-1).

EPCR (endoteliální receptor pro protein C) je také transmembránový protein. Je homologní sHLA 1. třídou/CD1 – spolupůsobící vimunitní odpovědi. Zvyšuje aktivaci PC na endotelu, snižuje antikoagulační působení APC.

2.3.2.3 Kuniny

2.3.2.4 Metaloproteinázy

2.3.2.5 Nespecifické inhibitory

2.3.3 Fibrinolytický systém

název

zkratky

2.3.3.1 Plazminogen, plazmin

2.3.3.2 Aktivátory plazminogenu

2.3.3.3 Inhibitory vsystému fibrinolýzy

2.3.3.4 Průběh fibrinolýzy

2.3.3.5 Funkce fibrinolytického systému