Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

Prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc., MUDr. Eva Tesařová a kolektiv

Hematologie a transfuzní lékařství II

Transfuzní lékařství

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

Vedoucí autorského kolektivu:
MUDr. Eva Tesařová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno

Autorský kolektiv:
RNDr. Libuše Janků – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno
MUDr. Hana Lejdarová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno
RNDr. Rita Pacasová, Ph.D. – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno
MUDr. Alena Pejchalová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno
MUDr. Eva Tesařová – Transfuzní a tkáňové oddělení FN Brno

Recenze:
MUDr. Jiří Masopust
MUDr. Renata Procházková, Ph.D.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

Autorky děkují paní Mgr. Olze Kopalové, vedoucí odborné redaktorce, za spolupráci při vzniku této publikace, paní Janě Řehákové, DiS., za pomoc při technické realizaci obrazové přílohy ke kapitole 1, oběma recenzentům a všem sponzorům, kteří vydání publikace finančně podpořili.

© Grada Publishing, a.s., 2012
Obrázky 1.1–1.18, 1.20–1.23, 1.25–1.34, 2.1–2.5, 4.1 podle podkladů autorek překreslila
Jana Řeháková, DiS.
Ostatní obrázky dodaly autorky.
Cover Photo © fotobanka allphoto, 2012
Vydala Grada Publishing, a.s., U Průhonu 22, Praha 7
tel.: +420 234 264 401, fax: +420 234 264 400
www.grada.cz
jako svou 5007. publikaci
Odpovědný redaktor Mgr. Luděk Neužil
Sazba a zlom Jana Řeháková, DiS.
Počet stran 192 + 16 stran barevné přílohy
1. vydání, Praha 2012
Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-3460-6

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

E-knihu ve formátu EPUB vytvořil Jan Löffelmann.

ISBN 978-80-247-7901-0 (ve formátu PDF)
ISBN 978-80-247-7904-1 (ve formátu EPUB)

Předmluva

Druhý díl publikace Hematologie a transfuzní lékařství předkládá text z oboru transfuzního lékařství, který je psán s didaktickým záměrem seznámit čtenáře s problematikou oboru a se základními postuláty hemoterapie, včetně specifik ve vztahu k péči o novorozence a děti vůbec. Jedná se o přehled, který definuje obzor základních vědomostí oboru a vymezuje platný legislativní rámec pro činnost zařízení transfuzní služby v České republice. Autorský kolektiv byl sestaven z odborníků vlastního pracoviště Fakultní nemocnice Brno, recenzemi byli pověřeni erudovaní kolegové s letitými praktickými zkušenostmi, kteří pravidelně v oboru transfuzního lékařství publikují.

Text publikace je rozdělen do čtyř logických celků, a to imunologie erytrocytů, imunologie leukocytů a trombocytů, včetně problematiky HLA systému, výroba transfuzních přípravků a hemoterapie. V kapitole hemoterapie je stručně popsána metodika zásobování nemocnic transfuzními přípravky v průběhu hromadných katastrof s postižením velkého počtu osob. Zároveň je v kapitole vymezena časová osa hemoterapie, kterou pro přehlednost určují významná historická data. Pro zvýšení didaktického účinku obsahuje publikace řadu schémat a obrázků, seznam zkratek a rejstřík.

Dovoluji si doufat, že publikace pomůže čtenářům proniknout do složité problematiky transfuzního lékařství, které v současnosti představuje průsečík několika lékařských specializací a mnoha vědních oborů.

Svým spoluautorům a recenzentům děkuji za úsilí, které vzniku publikace věnovali. Moje poděkování patří také sponzorům, kteří vydání této publikace finančně podpořili.

Eva Tesařová

Seznam použitých zkratek a jejich význam

Ab

antibody (protilátka)

AB0

skupinový systém erytrocytů AB0

ACD

1. antikoagulační roztok (acidum citricum, citrate, dextrose)

2. anaemia of chronic diseases (anémie chronických chorob)

ACE

acetylcholinesteráza

ADP

adenosindifosfát

ADSOL

adenine and dextrose solution (konzervační roztok)

Ag

antigen

AGH

antiglobulinum humanum (antiglobulinové sérum)

AIDS

acquired immunodeficiency syndrom

(syndrom získané lidské imunodeficience)

AIHA

autoimunitní hemolytická anémie

ALI

acute lung injury (akutní poškození plic)

AMP

adenosinmonofosfát

ANH

akutní normovolemická diluce

APC

antigen presenting cell (antigen prezentující buňka)

ARIP

anesteziologie, resuscitace a intenzivní péče

ATP

adenosintrifosfát

C

komplement

C1–C9

složky komplementu

CCI

corrected count increment

(přepočítaný vzestup počtu trombocytů po transfuzi)

CJD

Creutzfeldt-Jacob disease (Creutzfeldtova-Jacobova choroba)

CMV

cytomegalovirus

CPD

antikoagulační roztok (citrate, phosphate, dextrose)

CPDA

antikoagulační roztok

(citrate, phosphate, dextrose, adenine)

CSF

colony stimulating factor

ČČK

Český červený kříž

ČLS JEP

Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně

ČR

Česká republika

D variant

parciální D-antigen

D weak

slabý D-antigen

DAF

decay accelerating factor

DDAVP

1-deamino-8-D-arginin vazopresin

DEPH

di(2-etylhexyl)ftalát

DIFT

destičkový imunofluorescenční test

Dia

antigen erytrocytů Diego (a)

DIC

disseminated intravascular coagulopathy

(diseminovaná intravaskulární koagulace)

Dib

antigen erytrocytů Diego (b)

DMSO

dimetylsulfoxid

DNA

kyselina deoxyribonukleová

Doa

antigen erytrocytů Dombrock (a)

Dob

antigen erytrocytů Dombrock (b)

DP

double population (dvojí populace erytrocytů)

EBR

erytrocyty bez buffy coatu resuspendované

EBV

virus Epsteina-Barrové

EIA

enzymová imunoanalýza

ELFO

elektroforéza

ELISA

enzyme linked immunosorbent assay

EU

Evropská unie

FI

faktor I, fibrinogen

FEIBA

factor eight inhibitor bypassing activity

FVIII: C

koagulační aktivita faktoru VIII

FV

faktor V

FCM

flowcytometry (průtoková cytometrie)

FFP

fresh frozen plasma (čerstvá zmražená plazma)

FITC

fluoresceinizothiokyanát

FMAIT

fetomaternální aloimunitní trombocytopenie

FMH

fetomaternal haemorrhage (fetomaternální krvácení)

FHTR

febrile haemolytic transfusion reaction

FNHTR

febrile nonhaemolytic transfusion reaction

FSF

fibrin stabilizující faktor (faktor XIII)

FTA

fluorescence Treponema absorbtion

FUT

fukosyltransferáza

Fya

antigen systému Duffy (a)

Fyb

antigen systému Duffy (b)

GA

granuloaglutinační test

GCT

granulocytotoxický test

GIFT

granuloimunofluorescenční test

GP

glykoprotein

GvHD

graft versus host disease (reakce štěpu proti hostiteli)

HBV

hepatitis B virus (virus hepatitidy B)

HBsAg

povrchový antigen viru hepatitidy B

Hc

hematokrit cílový

HCV

hepatitis C virus (virus hepatitidy C)

HHV

human herpes virus

HIV

human immunodeficiency virus

(virus lidské imunodeficience)

HIT

heparinem indukovaná trombocytopenie

HLA

human leukocyte antigen

(lidský hlavní histokompatibilní systém)

HMA

human monocyte antigen

HNA

human neutrophil antigen

HOFN

hemolytické onemocnění fetu a novorozence

HON

hemolytické onemocnění novorozence

HPA

human platelet antigen

Hs

hematokrit střední

HSV

herpes simplex virus

Hv

hematokrit výchozí

HVLP

hromadně vyráběný léčivý přípravek

ICHS

ischemická choroba srdeční

Ig

imunoglobulin

INR

international normalised ratio

(mezinárodní normalizovaný poměr)

i.m.

intramuskulární aplikace

IMIG

imunoglobuliny pro intramuskulární aplikaci

ITP

imunitní trombocytopenie

ITT

immune tolerance therapy (imunotoleranční léčba)

IU

international unit (mezinárodní jednotka)

IUT

intrauterinní transfuze

i.v.

intravenózní aplikace

IVIG

imunoglobuliny pro intravenózní aplikaci

IVLP

individuálně vyráběný léčivý přípravek

Jka

antigen systému Kidd (a)

Jkb

antigen systému Kidd (b)

KTC

krizové transfuzní centrum

LDH

laktát dehydrogenáza

LISS

low ionic strength salt solution

(solný roztok s nízkou iontovou silou)

LISS NAT

nepřímý antiglobulinový test s použitím LISS

Lea

antigen systému Lewis (a)

Leb

antigen systému Lewis (b)

Lua

antigen systému Lutheran (a)

Lub

antigen systému Lutheran (b)

MAC

membrane attack complex

MAIPA

monoclonal antibody-specific immobilization of platelet

antigens

MASP

MBL-associated serine proteases

MBL

mannose binding lectin

MEIA

enzymová imunoanalýza na mikročásticích

MF

mixed field (smíšená populace, smíšené reakce)

MHC

major histocompatibility complex

(hlavní histokompatibilní systém)

MZ

ministerstvo zdravotnictví

NaCl

chlorid sodný, fyziologický roztok

NAIN

novorozenecká aloimunitní neutropenie

NAIT

novorozenecká aloimunitní trombocytopenie

NAT

1. nepřímý antiglobulinový test

2. nucleic acid amplification techniques

(metoda amplifikace nukleových kyselin)

NEC

nekrotizující enterokolitida

NK

1. natural killer (NK buňka)

2. nukleová kyselina

NRL

Národní referenční laboratoř

OBI

occult (hepatitis) B infection

PAMPS

pathogen associated molecular patterns

PAO

předoperační autologní odběr

PAT

přímý antiglobulinový test

PAS

platelet aditive solution

(náhradní roztok pro skladování trombocytů)

PEG

polyetylenglykol

PCH

paroxyzmální chladová hemoglobinurie

PCR

polymerase chain reaction (polymerázová řetězová reakce)

PCR-SSO

PCR s následnou hybridizací se sekvenčně specifickými

oligonukleotidy

PCR-SSP

PCR se sekvenčně specifickými primery

PE

phycoerythrin

PID

primární imunodeficience

PIGA

gen kódující změny u paroxyzmální noční hemoglobinurie

PNH

paroxyzmální noční hemoglobinurie

plt

platelets (trombocyty)

PSK

perioperační sběr krve

PT

prothrombin time (protrombinový čas)

PTP

potransfuzní trombocytopenická purpura

PVC

polyvinylchlorid

q PCR

quantitative polymerase chain reaction

RIA

radio immuno assay

Rh

skupinový systém erytrocytů Rhesus

rhG-CSF

rekombinantní faktor stimulující granulocyty

RhIg

anti-D imunoglobulin (Rh imunoglobulin)

RNA

kyselina ribonukleová

RRR

rychlá reagínová reakce

rt PCR

real time polymerase chain reaction

SAGM

konzervační roztok (solution of adenine, glukose, mannitol)

SBT

sequencing based typing

s.c.

subkutánní aplikace

SCIG

imunoglobuliny pro subkutánní aplikaci

SD

solvent detergent

SID

sekundární imunodeficience

SMP

small membrane protein

SOP

standardní operační postup

SPC

statistic process control (statistická analýza procesu)

SPHA

solid phasis haemadsorbtion

SSPt

náhradní resuspenzní roztok pro trombocyty

STL

Společnost pro transfuzní lékařství

SZÚ

Státní zdravotní ústav

TACO

transfusion acute circulatory overload

TAD

trombocyty z aferézy deleukotizované

TA-GvHD

transfusion associated graft versus host disease

(reakce štěpu proti hostiteli vázaná na transfuzi)

TBBV

total body blood volum (objem cirkulující krve)

T.D.

terapeutická dávka

TIBC

total iron binding capacity (celková vazebná kapacita železa)

TNF

tumor necrosis factor

TP

transfuzní přípravek

TPHA

Treponema passive hemagglutination

TP-PA

Treponema pallidum particule aglutination

TRALI

transfusion related acute lung injury

TSE

transmisivní spongiformní encefalopatie

TTI

transfusion transmited infection

TTD

transfusion transmited diseases

TTP

trombotická trombocytopenická purpura

T.U.

transfuzní jednotka

ÚILC

Ústřední informační a logistické centrum

UV

ultraviolet (ultrafialové záření)

v.

véna (žíla)

vCJD

variant Creutzfeldt-Jacob disease

(variantní forma Creutzfeldtovy-Jacobovy choroby)

vWF

von Willebrandův faktor

vWF:Ag

antigen von Willebrandova faktoru

vWF:RCof

ristocetin kofaktor, kofaktor von Willebrandova faktoru

VZV

varicella zoster virus

WNV

west Nile virus

WHO

World Health Organisation (Světová zdravotnická organizace)

Yta

antigen erytrocytů Cartwright (a)

Ytb

antigen erytrocytů Cartwright (b)

ZTS

zařízení transfuzní služby

ZULP

zvlášť účtovaný léčivý přípravek

ZZ

zdravotnické zařízení

1 Imunologie erytrocytů

(A. Pejchalová)

1.1 Obecná imunohematologie

1.1.1 Imunitní systém

Imunitní systém zajišťuje obranu organizmu proti cizorodým molekulám. Základní funkcí imunitního systému je obranyschopnost, autotolerance a imunitní dohled. Formy imunity lze rozlišit na přirozenou a získanou.

Přirozená (nespecifická, vrozená) imunita je první linií obrany. Je založená na mechanizmech, které jsou stejně účinné proti různým antigenům, reaguje během minut až hodin. Patří kní faktory mechanické, které zabraňují vstupu mikroorganizmů do těla (kůže, sliznice), faktory chemické a biologické (opsoniny, fyziologická mikrobiální flóra), faktory humorální (komplementový systém, lysozymy, interferony), fagocytující buňky (monocyty/makrofágy, neutrofily), bazofily, eozinofily, žírné buňky, trombocyty a NK buňky. Receptory těchto buněk rozpoznávají cizorodé molekuly (PAMPS) a buňky imunitního systému patogeny ničí.

Získaná (specifická, adaptivní) imunita je pomalejší, reaguje vprůběhu dnů aje antigenně specifická. Je pro ni charakteristický vznik protilátek a buňkami zprostředkovaná odpověď na antigeny vsituacích, kdy buňky imunitního systému obsahují receptor pro daný antigen. Má schopnost imunologické paměti. V koordinaci této odpovědi hrají svoji roli různé signální molekuly, kterými jsou lymfokiny, cytokiny či chemokiny. Kbuňkám adaptivní imunity patří B a T lymfocyty. Po expozici antigenu proliferují B lymfocyty, které se diferencují do plazmatických buněk stvorbou protilátek (imunoglobulinů) a vznikají paměťové buňky. Podobně se Tlymfocyty po rozpoznáníantigenu diferencují do Tc nebo Th lymfocytů.

Zvláštním druhem buněk jsou specializované buňky dendritické a makrofágy (APC), které jsou schopné štěpit antigeny na peptidy a ve spojení s molekulamihlavního histokompatibilního komplexu (MHC) je předkládat T lymfocytům.

B lymfocyty rozeznávají solubilní antigeny proteinové a polysacharidové, některé lipidy, nukleové kyseliny a hapteny. T lymfocyty rozpoznávají nerozpustné proteinové antigeny, a to ve spojení sMHC I. nebo II. třídy pro lymfocyty Tc nebo Th. Protilátky se uplatňují vobraně proti extracelulárním (exogenním) antigenům, které neutralizují, opsonizují nebo vedou kaktivaci komplementu a lýze patogenů. Vobraně proti intracelulárním (endogenním) patogenům se uplatňuje buňkami zprostředkovaná cytotoxická odpověď súčastí T lymfocytů.

1.1.2 Antigeny

Imunogen je substance, která navodí imunitní odpověď.

Antigen je substance, která reaguje sprodukty specifické imunitní odpovědi (protilátkami).

Hapten je malá molekula, která je antigenní, ale nikoli imunogenní, avšak po vazbě na imunogenní nosič může vést k tvorbě protilátek.

Epitop je část antigenu, na kterou se naváže produkt specifické odpovědi (protilátka).

Protilátka je specifický protein, který vznikl jako odpověď na imunogen a který reaguje santigenem.

Imunogenicita (navození imunitní odpovědi) je závislá na cizorodosti patogenní molekuly. Imunitní systém rozlišuje za normálních okolností vlastní a cizí a reaguje na cizí molekuly, na jejich velikost (větší molekula je silnějším imunogenem) a složení (složené komplexy jsou více imunogenní), na fyzikální formu antigenu (solubilní antigen je méně imunogenní než pevná částice) a na způsob odstraňování antigenu z organizmu (fagocytované molekuly jsou více imunogenní). O imunogenicitě rozhoduje také způsob podání antigenu (např. intravenózní, subkutánní) a množství podané substance.

Antigenicita je schopnost antigenu specificky vázatprotilátky nebo receptory Tlymfocytů (obr. 1.1 v barevné příloze). Lze konstatovat, že všechny imunogeny jsou antigeny, ale ne všechny antigeny jsou imunogenní. Vimunohematologii se uplatňují převážně antigeny nezávislé na T lymfocytech, které přímo aktivují B lymfocyty anevyžadují pro tvorbu protilátky pomoc T buněk (které jsou vyžadované u reakce na proteinové antigeny). Typickým příkladem těchto antigenů jsou polysacharidové antigeny krevních skupin. Antigen je rozpoznán protilátkou nebo B lymfocytem na základě uspořádání jeho molekuly vmístě zvaném epitop (antigenní determinant). Následně tento antigen vyvolá polyklonální aktivaci B lymfocytů, kdy různé klony lymfocytů specifických pro daný antigen sekretují polyklonální protilátky, respektive heterogenní směs protilátek, kdy každá protilátka je specifická pro různé epitopy antigenu.

Kromě polyklonálních protilátek mohou vznikat také monoklonální protilátky, tvořené jediným B buněčným klonem. Ty mají stejný izotyp, tzn. obsahují stejný těžký imunoglobulinový řetězec, jsou biochemicky shodné a rozpoznávají stejný antigenní epitop.

Monoklonální protilátky lze vyrobit pomocí konstrukce hybridomu, tzn. izolací klonu B lymfocytů, který produkuje protilátku žádané specifity a jeho dalším pěstováním vbuněčné kultuře. Výsledkem této fúze buněk je hybridom, který tvoří stejné protilátky jako původní lymfocyt. Vimunohematologii se monoklonální protilátky používají kdiagnostickým účelům (diagnostická séra). Přínosné je však ijejich léčebné použití. Jiným typem reagencií používaných vimunohematologických laboratořích jsou lektiny. Jsou to látky, keré se podobně jako protilátky připojují ke specifickým antigenům buněk a vedou kaglutinaci. Nejčastěji používané jsou lektiny rostlinné, které reagují sjednoduchými cukry na povrchu buněk, např. s galaktózou, fukózou či galaktosaminem. Nejobvyklejší je jejich diagnostické použití přivyšetřování krevních podskupin.

1.1.3 Protilátky

Protilátky vplazmě jsou rozpustnou formou antigenně specifických receptorů Blymfocytů. Protilátky jsou glykoproteiny, které vznikají jako odpověď na imunogen areagují se specifickými antigeny. Připojují se kantigenům tak, že se každá protilátka váže ke specifickému antigennímu epitopu na základě vzájemné komplementarity („klíč a zámek“) vmístech označovaných jako variabilní domény. Proti jednomu epitopu vzniká řada protilátek, každá kopíruje jeho povrch jinak.

Kromě této základní funkce mají imunoglobuliny i jiné efektorové vlastnosti, např. mohou vázat komplement a tímuvolnit biologicky aktivní molekuly a vést klýze buňky nebo se připojit kjiným buňkám, které pro ně mají receptor (fagocyty, lymfocyty, žírné buňky, buňky placenty) a tyto buňky následně aktivovat kčinnosti.

Základní jednotka imunoglobulinu se skládá ze dvou stejnýchlehkých a dvou stejných těžkých řetězců, které jsou spojené disulfidickými vazbami (obr. 1.2 v barevné příloze). Lehké i těžké řetězce sestávají zčásti variabilní (Fab) a konstantní (Fc) a jsou stočeny do kompaktních globulí, tzv. domén. Středová část označovaná jako pantová je flexibilní a umožňuje vomezeném rozsahu pohyb Fab částí (obr. 1.3 a1.5 v barevné příloze). Vtomto místě lze protilátku štěpit. Proteolytickým štěpením papainem lze získat dva shodné Fab fragmenty dvou lehkých a dvou těžkých řetězců, které obsahují vazebná místa pro antigen (přitom každý fragment má jedno místo vazby) a fragment Fc, tvořený dvěma těžkými řetězci, který plní efektorovou funkci imunoglobulinu. Při štěpení molekuly imunoglobulinu pepsinem vzniká jeden fragment F(ab)2, který má dvě vazebná místa pro antigen a oddělená Fc část je rozložena na malé peptidy – proto nemá žádnou efektorovou funkci (obr. 1.4 vbarevné příloze).

Podle aminokyselin v těžkých řetězcích lze imunoglobuliny rozdělit do pěti imunoglobulinových tříd na izotypy IgG (γ řetězce), IgM (μ řetězce), IgA (α řetězce), IgD (δ řetězce) a IgE (ε řetězce). Dále je lze diferencovat na podtřídy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 a IgA2.

Lehké řetězce jsou dvojího typu: κ (kappa) nebo λ (lambda), ty poslední lze také rozlišit na subtypy λ1–4.

Imunoglobuliny tvoří heterogenní populaci různých tříd a podtříd těžkých řetězců srůznými typy a subtypy lehkých řetězců. Každá molekula imunoglobulinu se však liší od jiné protilátkové molekuly vazebným místem pro antigen, pro který je specifická.

Vimunohematologii se uplatňují IgG a IgM protilátky.

IgG se vyskytují jako monomery vplazmě i extravaskulárně a jsou transportovatelné přes placentu do oběhu plodu. Mohou vázat komplement, ale málokdy jej aktivují až klýze erytrocytů. Aktivace obvykle probíhá po C3 složku. Aktivace komplementu přitom vyžaduje, na rozdíl od IgM, dvě molekuly IgG k tomu, aby mohlo dojít k vazbě C1q složky komplementu na Fc fragment protilátek (obr. 1.6 v barevné příloze). Lytická vlastnost IgG je proto poměrně malá. Protilátky IgG se však snadno navazují na jiné buňky (makrofágy, monocyty, leukocyty), které mají receptor pro jejich Fc část. Spojením stěmito buňkami protilátka připraví navázaný antigen kodstranění fagocytózou (tzv. opsonizace) vretikuloendoteliálním systému.

IgM molekula má řetězce polymerizované do pentameru, dobře váže komplement a je schopná ho aktivovat až k hemolýze. Již jedna molekula IgM stačí kaktivaci komplementu. Zuvedeného důvodu mají IgM protilátky velkou lytickou schopnost, typická je hemolýza po podání AB0 inkompatibilní transfuze. Sohledem na strukturu má IgM velmi dobré aglutinující schopnosti, podobně jako IgG se váže na jiné buňky pomocí Fc receptoru. Jako jediný imunoglobulinový typ může IgM protilátku vytvořit za určitých patologických stavů (infekce) již i plod intrauterinně.

Podle příčiny vzniku jsou vimunohematologii protilátky děleny na tzv. přirozené a imunitní. U imunitních protilátek se předpokládá, že jejich tvorbě předcházela imunizace jedince erytrocytárními antigeny při transfuzi nebo běhemtěhotenství na rozdíl od přirozených protilátek, které si organizmus vytváří sice také po antigenní stimulaci, avšak při běžném kontaktu santigeny zokolního prostředí. Tyto antigeny bývají chemicky podobné antigenům krevních skupin.

Jiné rozdělení protilátek je na skupiny aloprotilátek a autoprotilátek, tedy podle toho, zda se antigen, proti kterému protilátka vznikla, nenachází nebo nachází na erytrocytech daného jedince. Autoprotilátky jsou projevem autoimunity.

Protilátky mohou být také namířené proti konkrétnímu erytrocytárnímu antigenu, ty označujeme jako specifické protilátky. Nespecifické nebo zkříženě reagující protilátky vykazují širokou reaktivitu srůznými nebo podobnými antigeny.

Podle optimální teploty, při které protilátky vážou antigen, lze protilátky rozdělit na tepelné, které reagují při tělesné teplotě 37 °C, a chladové, které lze nejlépe detekovat vtestech při teplotách od 20 °C do 23 °C (tzv. pokojová teplota) nebo při teplotách nižších.

Vimunohematologii běžně používané označení protilátky kompletní a inkompletní není imunologicky zcela přesné a vyjadřuje pouze vlastnost protilátek aglutinovat erytrocyty. U kompletních protilátek (často IgM) jde o přímou aglutinaci erytrocytů vsolném testu, u inkompletních protilátek (IgG) je kvyvolání aglutinace a kjejich průkazu obvykle nutná další „pomoc“ laboratorní úpravou testu, například změnou prostředí, ve kterém je test prováděný.

1.1.4 Komplementový systém

Komplement je součástí specifické i nespecifické imunity. Může opsonizovat bakterie při fagocytóze, aktivovat různé typy buněk, účastnit se regulace protilátkové odpovědi, působit při odstranění imunitních komplexů a apoptotických buněk. Na druhé straně však může nepříznivě ovlivňovat organizmus vsouvislosti se zánětem a poškozením tkání.

Komplementový systém se skládá zdvaceti odlišných sérových proteinů, které syntetizují různé buňky, například hepatocyty, makrofágy a buňky střevního epitelu. Některé složky komplementu se mohou vázat kimunoglobulinům nebo kbuněčné membráně. Jiné mají vlastnosti proenzymů, které po své aktivaci štěpí další proteiny komplementu. Přitom vznikají fragmenty jednotlivých proteinů, které aktivují buňky, zvyšují cévní permeabilitu a opsonizují bakterie.

Aktivace komplementu může nastat třemi způsoby: cestou klasickou, alternativní a lektinovou, na které navazuje cesta lytická (vznik membránového komplexu). Jejich aktivací vzniká C5 konvertáza a C5b fragment, které mají zásadní význam vaktivaci závěrečné cesty lytické (obr. 1.7).

Obr. 1.7 Cesty aktivace komplementu. Tři cesty aktivace komplementu se liší inicializačním podnětem: kontaktem s protilátkou, chemickou látkou (endotoxinem bakterií) nebo sérovým lektinem (upraveno podle Complement.Imunology. Mayer, Gene [online], 2011)

Klasická cesta aktivace komplementu se spouští vazbou C1 proteinu kFc oblasti IgG nebo IgM molekuly specifické protilátky. Spojení C1 sprotilátkou vyžaduje alespoň dvě molekuly protilátky, aby mohlo být pevné. Vzniklý aktivovaný C1qrs (C1q, C1r, C1s jsou subjednotky C1) enzymaticky štěpí C4 na fragmenty C4a a C4b a zahajuje tak celý komplex dalších dějů: C4b se naváže na buněčnou membránu, přitom fragment C4a je uvolněný do prostředí mimo buňku (aktivovaný C1qrs štěpí C2 na fragmenty C2a a C2b), C2a se spolu sC4b váže na membránu do komplexu C4bC2a nazývaného C3 konvertáza (štěpí C3 na fragmenty C3a a C3b), C3b vytváří spolu sC4b a C2a na membráně komplex C4bC2aC3b zvaný C5 konvertáza. Jejím vznikem končí klasická cesta aktivace (obr. 1.8 v barevné příloze).

Aktivace komplementu vyžaduje kromě aktivačních dějů také regulaci probíhajících procesů tak, aby nedošlo knadměrné produkci některých fragmentů. Vtéto regulaci se uplatňují inhibiční a inaktivační mechanizmy, které působí na různých úrovních. Patří knim C1 inhibitor, C3a inaktivátor, faktory H a I (ovlivňují C3b), C3-INA (působí na C4a) a C4 binding protein (degraduje C4b).

Alternativní cesta aktivace komplementu začíná aktivací C3 a vyžaduje faktory B a D a kationty hořčíku, které jsou všechny obsaženy vséru (obr. 1.9 v barevné příloze). Vaktivaci alternativní cesty se neuplatňují protilátky, patří však kprvní linii obrany organizmu proti infekcím.

Lektinová cesta aktivace komplementu je podobná cestě klasické (obr. 1.10 v barevné příloze). Zahajuje ji vazba lektinu (MBL – mannose binding lectin) na bakteriální povrchy obsahující polysacharidy (manany), při které vznikají další proteázy: MASP-1 a MASP-2 (mannose associated serine proteases). Proteázy spolu slektinem vytváří biologicky aktivní komplex, který následně štěpí jednotlivé složky komplementu.

Lytická cesta aktivace komplementu (vznik membránového komplexu) od C5konvertázy přes připojení C6, 7, 8 a vazbu C9 vede klýze buňky. Lýza nepředstavuje enzymatický proces, ale fyzikální poškození membrány. Konečný komplex C5bC6C7C8C9 je označován jako MAC. C5 je biologicky aktivní látka, silný anafylatoxin a chemotaktický faktor pro neutrofily, stimuluje makrofágy. Někdy může dojít k uvolnění C5b67 komplexu zmembrány a jeho vazbě na jiné buňky, které mohou podléhat rozpadu. Proces se označuje jako „bystender“ lýza (obr. 1.11 v barevné příloze).

Vimunohematologii erytrocytů nachází uplatnění (sohledem na reakci protilátek santigeny erytrocytů) cesta klasická a lytická, výjimečně lektinová.

Souvislost komplementu s krevními skupinami byla zjištěna poprvé ukrevní skupiny Chido/Rogers. Antigeny skupiny Chido/Rogers jsou determinantami C4složky komplementu a na erytrocyty jsou adsorbované zplazmy, ve které jsou běžně přítomné. Jedinci Ch/Rg negativní jsou vzácní a mohou se u nich vyskytovat protilátky proti těmto antigenům. Protilátky však nejsou považované za nebezpečné, nebývají příčinou závažnější transfuzní komplikace.

Jiné spojení s komplementem mají antigeny skupiny Cromer, které se nachází na glykoproteinu DAF (decay accelerating factor, CD55). Ten je jako membránový protein na různých buňkách včetně erytrocytů, leukocytů, trombocytů, buňkách epitelu a endotelu a uplatňuje se jako regulátor komplementu přiobraně autologních buněk před poškozením komplementem.

Komplement mohou aktivovat klasickou cestou AB0 protilátky i některé nepravidelné antierytrocytární protilátky, které vznikly jako následek imunitní odpovědi na cizorodé antigeny erytrocytů vtransfuzi nebo na antigeny plodu v těhotenství, např. protilátky proti skupinám Duffy, Kidd, Kell. Tyto aloprotilátky mohou vést khemolýze erytrocytů, které nesou antigen, proti kterému je protilátka specifická. Jinou příčinou hemolýzy mohou být některé léky, které aktivují různými mechanizmy vznik protilátek a vedou k imunokomplexům, závislých na komplementu. Hemolýza může probíhat rychle, akutně sprojevy intravaskulární hemolýzy, kdy dochází k aktivaci komplementu lytickou cestou (obvykle při transfuzi AB0 inkompatibilních erytrocytů), nebo může probíhat pomaleji, spozdními příznaky, obvykle při extravaskulárním rozpadu erytrocytů (při inkompatibilitě erytrocytů např. vRh antigenech), kdy proběhne aktivace komplementu klasickou cestou a nenavazuje část lytická (obr. 1.12 v barevné příloze). Situace se klinicky projevují jako hemolytické reakce (u novorozence hemolytické onemocnění novorozence), které mohou mít vzávislosti na množství antigenu a protilátky a sohledem na imunologické vlastnosti protilátky různou intenzitu avtěžkých případech mohou končit i fatálně.

Analogií efektu komplementu u potransfuzní hemolýzy je úloha komplementu u autoimunitních hemolytických anémií, kdy zvláště u patologických chladových protilátek, typicky u Donathova-Landsteinerova autohemolyzinu, lze komplement prokázat na erytrocytech nemocných pacientů pomocí anti-C3d protilátky.

Komplement se uplatňuje také vpatogenezi paroxyzmální noční hemoglobinurie (PNH).

1.1.5 Reakce antigenu s protilátkou

Protilátky se připojují k antigenům nekovalentními vazbami. Ktěm patří spojení vodíkové, elektrostatické síly, Van der Waalsovy síly a hydrofobní vazby. Tyto vazby jsou slabé, fungují jen na malou vzdálenost a jsou reverzibilní (obr. 1.13). Pevné spojení protilátky a antigenu vyžaduje velké množství vazeb a vysokou vzájemnou komplementaritu antigenu a protilátky.

Afinita je síla vazby mezi jedním epitopem antigenu a jedním vazebným místem protilátky.

Avidita je síla vazby antigenu, který obsahujevícečetné epitopy smultivalentními protilátkami (obr. 1.14).

Obr. 1.13 Nekovalentní vazebné síly ovlivňující spojení antigenu sprotilátkou (reverzibilní vazby) (upraveno podle Antigen-antibody interactions involve a variety of forces. The noncovalent forces that hold together the antigen:antibody komplex [online], 2011)

Obr. 1.14 Afinita a avidita protilátky. Suma jednotlivých nekovalentních vazeb mezi paratopem a epitopem se rovná afinitě protilátky pro daný epitop. Avidita vyjadřuje pevnost vazeb mezi antigenem a protilátkou – jsou zřejmé rozdíly mezi izotypem IgG a IgM (upraveno podle Mayer, Gene. Immunoglobulins-Antigen-Antibody reaction. Avidity. Immunology Chapter Seven [online], 2011)

Specifičnost reakce je vlastnost protilátky reagovat jen sjedním epitopem, obecně vlastnost protilátek reagovat jen sjedním antigenem.

Zkřížená reaktivita je schopnost protilátky reagovat svíce než jedním epitopem, pokud jsou zkříženě reagující epitopy podobné antigenu, který navodil imunizaci.

Vzájemné spojení antigenu a protilátky ovlivňují různé faktory. Patří knim: teplota, při které protilátka optimálně reaguje santigenem a jež také určuje klinický význam protilátky (klinický význam je ekvivalentní hemolýze erytrocytů). Většina klinicky významných protilátek reaguje při teplotě 37 °C. Výjimkou jsou AB0 protilátky. Při vyšší teplotě může dojít kuvolnění protilátky zvazby na antigen, toho se využívá diagnosticky např. u elučních testů.

Poměr množství antigenu a protilátky musí být vyvážený, má vliv na počet vznikajících komplexů. Základním požadavkem pro síly mezi molekulami je co nejtěsnější přiblížení antigenu a protilátky tak, aby se mezi nimi mohly uplatnit přitažlivé síly. Sílu vazby mezi dvěma částicemi, tedy míru afinity protilátky, lze vyjádřit pomocí tzv. rovnovážné konstanty, která je měřítkem pevnosti vazby (disociace molekul) a charakterizuje efektivnost této vazby. Při interakci antigenu a protilátky tedy vzniká rovnovážný stav, kdy je při vzájemné rovnováze rychlost asociace rovna rychlosti disociace. Při vysoké koncentraci protilátky, např. při jejím nadbytku, je inhibována aglutinace (efekt prozóny).

Optimální pH prostředí je pro různé protilátky odlišné, ale obecně jsou používány testy spH kolem hodnoty 7. Snížení pH zvyšuje disociaci protilátky zkomplexu santigenem.

Doba inkubace je čas potřebný kdosažení rovnováhy mezi molekulami antigenu a protilátky. Pro různé protilátky závisí na třídě imunoglobulinu a schopnosti připojení protilátky ke specifickému antigenu. Přibližně 25 % z celkového množství protilátky se vsolném roztoku naváže na antigen během prvních 15 minut, zbývajících 75% v průběhu hodiny. Přidání dalších látek může ovlivnit množství protilátky, které se váže vprvních desítkách minut a zkrátit tím i celkový čas inkubace. Odpudivé síly mezi antigenem a protilátkou mohou být redukované snížením iontové síly prostředí. Obecně platí, že se snížením koncentrace NaCl dochází ke zlepšení vazby protilátky. Průběh reakce dále ovlivňuje počet (množství) antigenních epitopů a jejich vzájemná vzdálenost na membráně erytrocytu nebo imunologické vlastnosti protilátky.

1.1.6 Imunohematologické testy

Principem imunohematologických testů je aglutinační reakce. Vprvní fázi reakce erytrocytárního antigenu sprotilátkou dojde ke spojení protilátky a antigenu, ktzv. senzibilizaci erytrocytu. Aby následně vznikla hemaglutinace je nutné, aby se protilátka navázala ještě na jiný erytrocyt, tzn. aby překlenula vzdálenost 7–8 nm, která odpovídá průměru erytrocytu. Vzdálenost mezi vazebnými místy pro antigen je umolekuly IgG maximálně 14 nm, u IgM 35 nm. Sohledem na tyto vzdálenosti může velká molekula IgM snadněji aglutinovat erytrocyty než molekula IgG. Navíc IgM protilátka má ve srovnání sprotilátkou IgG pětkrát více vazebných míst.

Pomocí aglutinace je možné vyšetřovat antigeny na erytrocytech (krevní skupiny) i protilátky proti erytrocytům vséru či plazmě. Vpřímé aglutinaci se uplatní ty protilátky, které jsou schopné překlenout vzdálenost mezi erytrocyty (erytrocyty od sebe oddělují odpudivé síly způsobené rozdílem velektrickém potenciálu mezi negativně nabitými erytrocyty a pozitivními ionty vokolním prostředí, tzv. zeta potenciál) a svými Fab fragmenty spojí antigeny na sousedních erytrocytech (obr.1.15).

Obr. 1.15 Elektronegativní zóna – „zeta potenciál“ erytrocytů a jeho vliv na aglutinaci. Při neutrálním pH se erytrocyty nacházejí vnegativním iontovém mraku a vzájemně se odpuzují. Tyto odpudivé síly se označují jako zeta potenciál. Tento potenciál musí protilátka překonat, aby došlo kaglutinaci (upraveno podle Blood bank antigens and antibodies [online], 2011)

To je charakteristické pro IgM (obr. 1.16). IgM protilátky reagují typicky při nízké teplotě a používají se jako monoklonální nebo polyklonální protilátky kvyšetření antigenů krevních skupin. Jsou však známé i IgG, které přímo aglutinují erytrocyty, a to zvláště vsituaci, kdy erytrocyty mají velký počet antigenních míst umístěných blízko sebe a malé molekule IgG se podaří sousedící erytrocyty spojit. K těmto patří např. protilátky anti-A, anti-B a anti-M.

Aglutinační testy je možné provádět sklíčkovou metodou, zkumavkovým testem, metodou pevné fáze nebo technikou sloupcové aglutinace. Aglutinační test lze také kvantifikovat pro stanovení množství protilátky pomocí sériového ředění vzorku, ve kterém se stanovují protilátky, kdy se ke každému ředění séra přidá vždy konstantní množství antigenu. Vtomto případě označujeme nejvyšší ředění, při kterém ještě nastala aglutinace, jako titr. Titrační vyšetření se používá většinou ke stanovení množství protilátky vséru těhotných žen nebo při vyšetření AB0 protilátek u dárců krve („high titre“ dárci svysokým množstvím anti-A, anti-B) a při speciálních testech pro průkaz slabých antigenů nebo protilátek.

Testy antiglobulinové (AGH testy, Coombsovy testy) jsou nejdůležitějšími imunohematologickými testy. Používají se kprůkazu protilátek, které přímo neaglutinují erytrocyty výše popsaným způsobem, pouze erytrocyty senzibilizují. Podle této vlastnosti bývají označované jako inkompletní protilátky. Aby bylo možné tyto protilátky prokázat, přidává se do reakce další protilátka proti původní, senzibilizující protilátce. Tento anti-imunoglobulin (AGH sérum, antiglobulinové sérum detekující lidskou protilátku) následně zajistí vzájemné spojení jednotlivých senzibilizovaných erytrocytů a vizualizuje aglutinační reakci. Test rozlišujeme ve dvou provedeních – jako přímý nebo nepřímý antiglobulinový test (obr. 1.17, obr. 1.18 vbarevné příloze).

Obr. 1.16 Princip aglutinační reakce, přímá vazba antigenu a protilátky (upraveno podle Mayer, Gene. Immunoglobulins-Antigen-Antibody reaction. Qualitative agglutination test. Immunology Chapter Seven [online], 2011)

Obr. 1.17 Princip antiglobulinových testů: PAT, NAT (upraveno podle Coombs test Hinds Community College in Mississippi [online], 2011)

Přímý antiglobulinový test (PAT) detekuje erytrocyty senzibilizované protilátkou in vivo vorganizmu. Používá se při průkazu imunitního typu hemolýzy upacientů po transfuzích, transplantacích, u potransfuzních reakcí, u hemolytického onemocnění novorozence, u pacientů sprojevy autoimunity, respektive klaboratornímu průkazu autoimunitní hemolytické anémie.

Nepřímý antiglobulinový test (NAT) slouží k průkazu protilátky proti erytrocytům, která se nachází volně vséru nebo v plazmě a kterou lze prokázat pomocí AGH séra až po inkubaci vyšetřovaného séra santigeny erytrocytů. Je to test, který prokazuje klinicky významné nepravidelné protilátky proti erytrocytům, určuje kompatibilitu erytrocytů při předtransfuzním vyšetření a lze jím vyšetřovat antigeny některých krevních skupin.

AGH sérum používané vantiglobulinových testech musí být komplexní, tzn. že musí obsahovat složku anti-IgG a anti-C3 proto, aby detekovalo protilátky IgG iprotilátky závislé na komplementu, kterými jsou všechny patologické chladové protilátky. Vněkterých situacích, vyžadujících objasnění nálezu, lze použít kvyšetření pouze anti-IgG složku, tzv. monospecifické AGH sérum.

Modifikované AGH testy mohou obsahovat reagencie, které dalším způsobem usnadňují vznik imunitních komplexů, např. se přidává polyetylenglykol nebo roztok o nízké iontové síle. Nepřímý antiglobulinový test, ve kterém je suspenze erytrocytů připravena vroztoku LISS, se označuje jako LISS-NAT. AGH testy provedené zkumavkově nebo na pevné fázi vyžadují precizní provedení. Před přidáním AGHséra je nutné odstranit zvyšetřované suspenze veškeré reziduální proteiny, které se nenavázaly na erytrocyty a které mohou AGH sérum neutralizovat a vést kfalešně negativnímu výsledku. Pro kontrolu správného provedení testu se proto přidávají knegativním testům kontrolní erytrocyty, kterými jsou erytrocyty senzibilizované IgG protilátkou. Pokud vreakčním prostředí zůstalo AGH sérum nespotřebované, reaguje s nimi pozitivní reakcí, která dokazuje validitu testu.

Metoda sloupcové aglutinace vgelu zavedla „no-wash“ techniku, při níž tekutý gel mikrozkumavek, který obsahuje AGH, propouští pouze erytrocyty, nikoli sérum nebo plazmu. AGH proto nelze zneutralizovat zbytkovými proteiny a zřetelně a jednoduše bez promývání detekuje a vizualizuje erytrocyty snavázanou protilátkou.

Kprůkazu senzibilizujících protilátek lze použít i enzymové testy, jejichž provedení sice není povinné, je však vhodné např. při vyšetření potransfuzních reakcí aupacientů opakovaně transfundovaných svelkým rizikem imunizace. Zenzymů se nejčastěji používají papain, bromelin a ficin. Proteázy zvyšují schopnost protilátek aglutinovat erytrocyty různými způsoby, např. snižují elektronegativní náboj erytrocytů, redukují množství kyseliny sialové na povrchu erytrocytové membrány, odstraňují některé membránové antigeny, či uvolňují molekuly vody zpovrchu erytrocytů.

Detekci protilátek lze také usnadnit přidáním dalších komponent, např. albuminu, polybrenu nebo výše zmíněného roztoku o nízké iontové síle, tj. látek, které obecně vedou ke zmenšení vzdálenosti mezi erytrocyty nebo zesilují vazbu mezi antigenem a protilátkou.

Vimunohematologii lze použít i jiné typy testů (metody průtokové cytometrie nebo radioimunologickou analýzu), které se však sohledem na jejich složité provedení nebo vysoké finanční náklady (při srovnání saglutinačními testy) rutinněnevyužívají. Stále rozšířenějšími se vimunohematologii stávají metody molekulárně-genetické, kterými lze určit genotyp, rozpoznat polymorfizmy krevních skupin, definovat anomální skupiny, určit zygozitu, tzn. například předpovědět riziko hemolytického onemocnění novorozence, zajistit vhodné erytrocyty pro polytransfundované pacienty, umožnit přesné vyšetření genotypů u dárců krve – tedy obecně zvýšit imunologickou bezpečnost transfuze.

Hodnocení aglutinačních reakcí

Zjištění rozsahu aglutinace je důležité, agregáty erytrocytů musí být správně zhodnocené a zaznamenané. Stupeň aglutinace dává přehled o množství vzniklých imunitních komplexů. Způsob, jakým je prováděno resuspendování sedimentu erytrocytů při vyšetření ve zkumavkových testech je zásadní pro správné zhodnocení výsledků – nadměrné třepání fragilních aglutinátů vede kfalešně negativním reakcím, naopak nedostačující resuspendování vede ke smíšeným reakcím. Pro hodnocení aglutinací je zavedený systém pro stanovení síly reakce, a to pro makroskopické a mikroskopické odečítání.

Odečítání výsledků reakcí vtestech sloupcové aglutinace má narozdíl od zkumavkových testů standardizovaný způsob hodnocení od 4+ reakce jako nejsilnější přes reakce typu dvojí populace, kdy nacházíme směs antigenně odlišných typů erytrocytů až knegativní reakci (obr. 1.19 vbarevné příloze).

1.2 Krevní skupiny

Obr. 1.20 Struktura membrány erytrocytů (upraveno podle Sant-RaynPasricha. The Red Cell Membrane: structure and pathologie [online], 2011)

1.2.1 AB0 systém

Chemické složení

Dědičnost

Gen A umožňuje vznik A transferázy, která katalyzuje připojení N-acetyl-galaktosaminu (GalNAc) kH antigenu, tj. galaktosamin je terminálním a imunodominantním monosacharidem pro A antigen.

lektin

4+

0

1.2.2 Rh systém

1.2.3 Ostatní krevní skupiny