Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

VYŠETŘOVACÍ METODY V IMUNOLOGII
2., přepracované a doplněné vydání

Editoři: Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc.
RNDr. Milan Paulík, CSc.

Autorský kolektiv: Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha
Doc. MUDr. Ondřej Hrušák, Ph.D., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha
RNDr. Milan Paulík, CSc., FN Thomayerova, Praha
Prof. MUDr. Karel Smetana, DrSc., Anatomický ústav UK 1. LF UK, Praha
Prof. MUDr. Anna Šedivá, DSc., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha
Doc. MUDr. Radek Špíšek, Ph.D., Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha
Ing. Luděk Šprongl, Nemocnice Šumperk
MUDr. Eva Vernerová, Ústav imunologie UK 2. LF UK a FN Motol, Praha

Technická spolupráce: Mgr. Štěpán Peterka

Recenze: Prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc.
Prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc., MBA

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

© Grada Publishing, a.s., 2011
Obrázky dodali autoři.
Obrázek 12 podle předlohy autorů překreslila Jana Řeháková, DiS.
Cover Photo © fotobanka allphoto, 2011
Vydala Grada Publishing, a.s.
U Průhonu 22, Praha 7
jako svou 4510. publikaci
Odpovědná redaktorka Šarlota Pokorná
Sazba a zlom Šarlota Pokorná
Počet stran 168 + 4 strany barevné přílohy
2. vydání, Praha 2011
Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.
Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-3533-7

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

ISBN 978-80-247-7089-5 pro formát PDF
ISBN 978-80-247-7090-1 pro formát EPUB

Seznam zkratek

ACA anticentromerové autoprotilátky

ACLA antikardiolipinové autoprotilátky (anticardiolipin autoantibodies)

ADCC buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)

AIDS syndrom získané imunodeficience (acquired immune deficiency syndrome)

ALPS autoimunitní lymfoproliferativní syndrom

ANA antinukleární autoprotilátky (antinuclear autoantibodies)

ANCA antineutrofilní cytoplazmatické protilátky (antineutrophil cytoplasmic anti-bodies)

APC buňka předkládající antigen (antigen-presenting cell)

aPTT aktivovaný parciální tromboplastinový čas

ASMA protilátky proti hladkému svalu (anti-smooth muscle autoantibodies)

BAT test aktivace bazofilů (basophile activation test)

BCG Calmetteův-Guérinův bacil

BCR receptor lymfocytů B (B cell receptor)

BPI protein zvyšující baktericidii a permeabilitu (bactericidal permeability increasing protein)

C1 INH inhibitor C1 složky komplementu

CAST test degranulace bazofilů

CD diferenciační antigen (cluster designation)

cDNA komplementární kyselina deoxyribonukleová (complementary DNA)

CDR oblast determinující komplementaritu (complementary determining region)

CFSE carboxyfluorescein succinimidyl ester

CGD chronická granulomatózní choroba (chronic granulomatous diseases)

CID kombinovaný imunodeficit (combined immunodeficiency)

CL chemiluminiscence

CMV cytomegalovirus

CNS centrální nervový systém

CRP C-reaktivní protein (C-reactive protein)

CTL cytotoxický lymfocyt T (cytotoxic T lymphocyte)

CVID běžný variabilní imunodeficit (common variable immunodeficiency)

DBPCT dvojitě slepý placebem kontrolovaný pokus (double blind placebo controled test)

DC dendritická buňka (dendritic cell)

DNA deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid)

dsDNA dvoušroubovice DNA (double stranded DNA)

DTH reakce pozdní přecitlivělosti (delayed hypersensitivity test)

EA časný antigen (early antigen)

EBNA nukleární antigen viru Epsteina-Barrové (EB nuclear antigen)

EBV virus Epsteina-Barrové (Epstein-Barr virus)

ECP eozinofilní kationický protein (eosinophil cationic protein)

EDTA kyselina dietylen tetraoctová

EHK externí hodnocení kvality

EIA enzymová imunoanalýza

ELISA enzymová imunoanalýza na imunosorbentech (enzyme-linked immunosorbent assay)

ENA extrahovatelné nukleární antigeny

FISH fluorescenční in situ hybridizace (fluorescent in situ hybridization)

FITC fluorescein izothyocyanát

FSc parametr analýzy u průtokové cytometrie (forward scatter)

GAD dekarboxyláza kyseliny glutamové (glutamic acid decarboxylase)

GAPDH glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza

G-CSF faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyte colony stimulating factor)

HBV virus hepatitidy B

HCV virus hepatitidy C

HIV virus lidské imunodeficience (human immune deficiency virus)

HLA hlavní komplex lidských histokompatibilních antigenů (human leukocyte antigen complex)

HLH hemofagocytující lymfohistiocytóza

CH100 celková hemolytická aktivita komplementu (100%)

CH50 celková hemolytická aktivita komplementu (50%)

IFN interferon

IgA imunoglobulin A

IgD imunoglobulin D

IgE imunoglobulin E

IgG imunoglobulin G

IgM imunoglobulin M

IL interleukin

INT jod-nitroblue tetrazolium

JCA juvenilní chronická artritida

LAD syndrom defektní adhezivity leukocytů (leukocyte adhesion deficiency syndrome)

LFA adhezivní molekula ze skupiny integrinů (leukocyte-function-associated antigen)

LKM protilátky proti mikrozomům jater a ledvin (liver-kidney microsomes antibodies)

MAC komplex složek komplementu atakující membránu a vyvolávající lýzu (membrane attack complex)

MALT slizniční imunitní systém (mucosa associated lymphoid tissue)

MBL lektin vázající manózu (mannose binding lectin)

MCTD smíšená choroba pojiva (mixed connective tissue disease)

MGUS monoklonální gamapatie nejasného významu (monoclonal gammapathy of un-known significance)

MHC molekuly tkáňové slučitelnosti (major histocompatibility complex), viz HLA

MPO myeloperoxidáza

MSHP mikrosférické hydrofilní partikule

NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfát (nicotinamid adenin dinucleotide phosphate)

NBT nitrotetrazoliová modř (nitroblue tetrazolium chlorid)

NK přirozený zabíječ (natural killer)

OPD ortofenylendiamin

PAA polyakrylamid

PAGE polyakrylamidová gelová elektroforéza

PBMC mononukleární buňky z periferní krve (peripheral blood mononuclear cells)

PCR řetězová polymerázová reakce (polymerase-chain reaction)

PE fykoerytrin

PEG polyetylenglykol

PHA fytohemaglutinin (phytohemaglutinin)

PI propidium jodid

PMA forbol myristát acetát (phorbol myristate acetate)

PMN polymorfonukleární leukocyty (polymorphonuclear cell)

PWM poke weed mitogen

RA revmatoidní artritida

RAST radioallergosorbent test

RF revmatoidní faktory

RIA radioimmunosorbent-assay

RISA ring-immunosorbent assay

RNA kyselina ribonukleová (ribonucleic acid)

RPMI médium

RT-PCR reverzně transkriptázová polymerázová řetězová reakce (reverse transcriptase polymerase chain reaction)

SCID těžký kombinovaný imunodeficit (severe combined immunodeficiency)

SI stimulační index

SLE systémový lupus erythematodes (systemic lupus erythematodes)

SSc parametr analýzy u průtokové cytometrie (side scatter)

SSP sekvenčně specifické primery

Tc cytotoxický lymfocyt T pro antigen (cytotoxic T cell)

TCR receptor lymfocytu T (T cell receptor)

TdT terminální deoxyribonukleotid transferáza

TGF transformující růstový faktor (transforming growth factor)

Th pomocný lymfocyt T (helper T cell)

TMB tetrametylbenzidin

TNF faktor nekrotizující nádory (tumor necrosis factor)

Tr regulační lymfocyt T (regulatory T cell)

TSH hormon stimulující tyroideu (thyreoid stimulating hormon)

VCA virový kapsidový antigen (viral capsid antigen)

VCAM vaskulární adhezivní molekula (vascular cell adhesion molecule)

Úvod

Uplynulo již dvacet let od doby, kdy se čtenářům dostala do rukou skvělá kniha Vybrané diagnostické metody v imunologii autorů J. Procházkové a C. Johna. Dodnes je tato pub-likace součástí knihovničky imunologických laboratoří. Pokud se nějaký student, ať již v pregraduálním, nebo postgraduálním studiu, chtěl něco dozvědět o základních imunologických technikách, sáhl po této knize. Doba však již pokročila a řada metod se změnila, některé zanikly, jiné přibyly. Studenti medicíny i přírodních věd, postgraduální studenti v biomedicíně, lékaři stážující v laboratoři před atestací z alergologie a klinické imunologie začali postrádat ucelenou stručnou publikaci, kde by se něco dozvěděli nejen o principech moderních metod, ale také o indikacích k vyšetření a interpretaci výsledků. Posledním impulzem k sepsání této příručky pak byla akreditace bakalářského studia v oboru Zdravotní laborant na 2. lékařské fakultě UK v Praze, a tedy potřeba moderních učebních textů pro tento specifický obor. Kolektiv interních a externích učitelů 2. lékařské fakulty UK se proto rozhodl zaplnit chybějící mezeru na trhu a přichází s touto publikací.

Kniha je koncipována jako praktická přehledná příručka pro klinické i laboratorní pracovníky zabývající se imunologií. V první kapitole je jako výchozí informace pro další texty stručně rekapitulována fyziologie a patologie imunitního systému. Druhá kapitola pojednává o metodikách, které se používají pro diagnostiku imunitních parametrů. Metodiky neobsahují podrobný pracovní protokol, spíše se orientují na principy metod, jejich úskalí, limity, uplatnění v diagnostice různých parametrů imunity. U jednotlivých metod je také zmíněno, jaké přístrojové vybavení metoda vyžaduje a jak je ekonomicky náročná.

Třetí kapitola se zabývá možnostmi stanovení jednotlivých parametrů imunity. Zatímco ve druhé kapitole jsou zmíněny metody (např. nefelometrie), třetí kapitola se zabývá tím, jakými metodami lze stanovit jednotlivé parametry imunity (např. imunoglobuliny– nefelometrií, radiální imunodifuzí …), jaké jsou výhody a nevýhody jednotlivých metod stanovení. Zároveň obsahuje odstavce o fyziologických hodnotách jednotlivých parametrů, popřípadě o specifitě nebo senzitivitě jednotlivých vyšetření a interpretaci patologických výsledků.

Čtvrtá kapitola obsahuje základní algoritmy vyšetření, která jsou indikována u jednotlivých druhů imunopatologických stavů – imunodeficiencí, autoimunitních a alergických chorob. Stručně jsou zmíněny i anamnestické a klinické aspekty, více pozornosti je věnováno laboratornímu spektru. Je zařazena i kapitola o možnostech monitorování protinádorové imunity, neboť předpokládáme, že imunoterapie se v blízké budoucnosti přenese z vědeckého experimentu do klinické praxe a požadavky na imunologické laboratoře se v tomto směru zvýší.

Poslední kapitola je věnována problematice akreditace, certifikace a standardizace v klinických laboratořích.

Oproti starší publikaci Procházkové a Johna neobsahuje kniha podrobné laboratorní protokoly. Doba se změnila a celá řada testů je dodávána výrobci v kompletech, setech nebo je zcela automatizována. Učebnice by byla v tomto aspektu nerovnoměrná: byly by podrobně popsány metody na vyšetření funkcí buněčných složek imunity, které jsou stále založeny na manuálním zpracování, zatímco u většiny testů humorální imunity by bylo napsáno – „zkumavku s krví dáme do analyzátoru a počkáme na výsledek“ nebo „postupujeme dle návodu výrobce“.

Doufáme, že publikaci shledají jako užitečnou lékaři a přírodovědci vzdělávající se v problematice klinické a laboratorní imunologie, postgraduální studenti v biomedicíně přicházející do styku s laboratorními metodami, posluchači bakalářského studia a vyššího odborného studia oboru zdravotní laborant, ale i biochemici, mikrobiologové, farmakologové a také kliničtí lékaři jiných odborností.

Předmluva k 2. vydání

Na začátku školního roku 2009/2010 jsme si uvědomili při úvodní přednášce pro bakalářský obor zdravotní laborant, že při doporučování studijní literatury slovy: „Používejte naši novou učebnici Laboratorní vyšetřovací metody v imunologii,“ mluvíme o knize s rokem vydání 2005. Což znamená, že doporučujeme učebnici starou pět let. Rozhodli jsme se, že pro další školní rok učebnici inovujeme.

Ponechali jsme obdobnou strukturu jako v předešlém vydání, neboť jsme měli na tuto koncepci velmi pozitivní ohlasy. V nové učebnici jsme se snažili zachytit obraz počátku 21. století v imunologických laboratořích. Rozvoj laboratorních technik jde jako rozvoj všech technologií v lidské činnosti nezadržitelně kupředu, ale i v době špičkových technologií zůstávají některé metody „zlatým a prověřeným standardem“ a leckdy se jen obtížně nahrazují moderními technikami. Výpovědní hodnota některých nových technologií pro klinickou diagnostiku není v zásadě o moc přínosnější, než je tomu u metod klasických, přičemž finanční náročnost je někdy enormní. Zmínili jsme metody, které přinejmenším v principu ještě dlouho nezastarají (reakce založené na vazbě antigen–protilátka se po-užívají již více než 80 let). Doplnili jsme metody, které nyní nejsou zcela rutinní, ale již se „o nich ví“, a můžeme očekávat, že si zanedlouho najdou své místo v laboratorní diagnostice, a které již v současnosti tvoří arzenál výzkumných laboratoří. Přestože je naše učebnice zaměřena zejména na laboratorní techniky a jejich význam, snažili jsme se, byť jen ve stručnosti, zmínit, že laboratorní vyšetření není samospasitelné a že ani v éře biočipů, mikroarraí a průtokové cytometrie neztratí v diagnostice imunopatologického stavu svůj význam anamnéza, fyzikální vyšetření a další pomocné vyšetřovací metody.

Za kolektiv autorů editoři

1 Stručná fyziologie apatologie imunitního systému

Jiřina Bartůňková

1.1 Složky afunkce imunitního systému

Imunitní systém patří spolu sendokrinním anervovým systémem kregulačním mechanizmům organizmu, které zajišťují jeho celistvost audržování vnitřního prostředí (homeostázu). Základní vlastností imunitního systému je schopnost rozpoznat škodlivé od neškodného, cizí od vlastního. Škodliviny zevního ivnitřního původu jsou likvidovány, neškodné je tolerováno. Unikátní vlastností imunity, obdobnou nervové soustavě, je schopnost učení apaměti. Funkce imunitního systému zajišťuje vzájemná provázanost mechanizmů imunity přirozené – nespecifické aadaptivní – specifické. Do nespecifické imunity patří polymorfonukleární leukocyty, monocyty, makrofágy adendritické buňky arůzné součásti plazmy, jako je komplement aproteiny akutní fáze. Do specifické imunity patří lymfocyty T alymfocyty B, které se po diferenciaci do plazmatických buněk stávají producenty protilátek.

Látka, která je schopna vyvolat imunitní reakci, se nazývá antigen. Zchemického hlediska jsou antigeny většinou bílkoviny (proteiny) nebo bílkoviny spolu scukernými složkami – glykoproteiny. Mohou však být ipovahy tukové (lipidy, fosfolipidy, glykolipidy) acukerné (polysacharidy). Pokud je antigen zevního původu, označuje se jako exoantigen. Jedná se nejčastěji osložky mikroorganizmů. Jako alergen se označuje exoantigen, který je schopen uvnímavého jedince navodit nepřiměřenou imunologickou reakci – alergickou reakci. Alergeny mohou být pyly, zvířecí srst, potraviny, léky adalší látky. Struktury vlastních tkání, proti nimž se vyvíjí imunitní reakce, se nazývají autoantigeny. Malé molekuly, které jsou schopny vyvolat imunitní reakci pouze po vazbě na makromolekulární nosič (např. albumin), jsou nazývány hapteny (např. léky). Malá oblast molekuly antigenu, která je rozeznávána antigenně specifickými receptory, se nazývá epitop.

Laboratorní imunologické metody jsou vpřevážné většině založeny na reakci antigen–protilátka (kapitola 2). Antigenem vtěchto reakcích může být jakákoliv složka, která je vyšetřována, tj. iprotilátka (např. lidský imunoglobulin). Protilátkou je pak vsystémuzvířecí imunoglobulin, který byl vyroben imunizací zvířete zkoumanou lidskou protilátkou, neboť ta coby cizorodá bílkovina představuje pro zvířecí imunitní systém antigen.

Buňky imunitního systému spolu spojivovými buňkami adalšími strukturami tvoří anatomické afunkční celky – lymfatické orgány atkáně. Buňky zajišťující imunitní reakce se nazývají imunokompetentními buňkami. Centrálními lymfatickými orgány jsou kostní dřeň abrzlík (tymus). Jsou to místa, kde dochází ke vzniku, diferenciaci azrání imunokompetentních buněk. Vkostní dřeni vznikají všechny imunitní buňky ze společné kmenové buňky. Ta se dále diferencuje na myeloidní alymfoidní buněčné linie. Zmyeloidní linie vznikají červené krvinky akrevní destičky adva druhy bílých krvinek, granulocyty amonocyty. Zlymfoidní linie vzniká další druh bílých krvinek – lymfocyty. Ty, které se dále vyvíjejí vtymu, se označují jako lymfocyty T. Vkostní dřeni se vyvíjí celá linie myeloidní alymfocyty typu B, znichž se posléze stávají buňky plazmatické, které produkují protilátky. Mezi imunokompetentní buňky se řadí také buňky dendritické, jejichž hlavní funkcí je pohltit azpracovat antigen, vystavit jej na svém povrchu apřilákat příslušné lymfocyty T aB, které pak rozvinou imunitní reakci.

Periferní (sekundární) lymfatické orgány atkáně jsou místem, kde probíhá imunitní reakce akde se diferencují lymfocyty T aB do výkonných populací. Patří sem slezina, lymfatické uzliny alymfatická tkáň asociovaná se sliznicemi (MALT – mucous associated lymphoid tissue). Anatomická struktura periferních lymfatických orgánů umožňuje optimální spolupráci lymfocytů T aB sbuňkami prezentujícími antigen. Dochází kjejich aktivaci, růstu, diferenciaci akonečnému vzniku výkonných lymfocytů. Lymfatické orgány atkáně jsou propojeny sítí lymfatických akrevních cév. Nově vzniklé lymfocyty se dostávají zcentrálních do periferních lymfatických orgánů krevním řečištěm, odkud přestupují cévní stěnou. Sekundární lymfatický orgán opouštějí lymfatickými cévami, jimiž se dostávají cirkulací do tkání.

Pro imunitní reakce jsou důležité interakce imunokompetentních buněk sdalšími buňkami, které nepocházejí zhematopoetických (krvetvorných) kmenových buněk. Patří sem například folikulární dendritické buňky, endotelie (výstelka cév), buňky nervového systému, epiteliální buňky sliznic afibroblasty.

Funkce imunitního systému vykonávají jednak některé součásti krevního séra, nazývané humorální faktory, ajednak krevní buňky. Buňky kolují vkrevním amízním oběhu avpřípadě potřeby vycestují do místa, kde je jich potřeba. Některé buňky imunitního systému jsou usazeny vtkáních anecestují. Podle toho, zda se vimunitní reakci více uplatní humorální faktory nebo buňky, se složky imunity rozdělují na humorální abuněčné. Podle toho, jakým způsobem imunitní složky rozpoznávají antigen, dělíme imunitní systém na složky specifické (adaptivní) anespecifické (přirozené). Všechny složky imunity spolu úzce spolupracují anavzájem se ovlivňují aregulují buď přímým kontaktem zprostředkovaným adhezními molekulami na buněčném povrchu, nebo rozpustnými mediátory, zejména cytokiny. Základní charakteristiky buněčné ahumorální imunity uvádí tabulka 1.

Tab. 1 Srovnání humorální abuněčné imunity

humorální

buněčná

nespecifické složky

proteiny akutní fáze, komplement

buňky NK, neutrofilní leukocyty, monocyty, makrofágy

specifické složky

protilátky

lymfocyty T

hlavní funkce

obrana proti extracelulárně žijícím mikroorganizmům (opsonizace)

obrana proti intracelulárně žijícím mikroorganizmům, u neutrofilů i obrana proti extracelulárním mikroorganizmům, zánětlivá reakce

materiál na vyšetření

sérum, plazma, ev. jiné tekutiny (sliny, mozkomíšní mok)

nesrážlivá krev, bioptické vzorky tkání, ev. jiné zdroje (mozkomíšní mok, bronchoalveolární laváž)

1.2 Buněčné složky imunity

Do buněčné imunity nespecifické patří fagocytující buňky (polymorfonukleáry amonocyty/makrofágy) abuňky NK (tzv. přirození zabíječi – zanglického natural killer cells). Specifickou složku tvoří lymfocyty T. Po aktivaci produkují tyto buňky rozpustné mediátory, zvané cytokiny. Ty aktivují další složky imunity nebo samy sebe astávají se znich buňky regulační nebo zabíječské (cytotoxické).

Buněčná imunita se uplatňuje vobraně organizmu proti virovým, plísňovým aněkterým bakteriálním infekcím (způsobeným nitrobuněčnými parazity, např. mykobakteriemi) avobraně proti nádorům (zejména vyvolanými onkogenními viry). Vtransplantační medicíně se buněčné složky podílejí na odvržení transplantované tkáně. Složky buněčné imunity se vyšetřují znesrážlivé krve.

1.2.1 Buněčná imunita nespecifická

1.2.1.1 Fagocytující buňky

Fagocytující buňky jsou buď monocyty/makrofágy, nebo polymorfonukleární leukocyty. Jsou nadány schopností fagocytózy, která zahrnuje putování za škodlivinou (chemotaxi), její rozpoznání, pohlcení, zpracování, usmrcení asekreci látek, které působí na ostatní systémy imunity adalší tkáně organizmu. Na membráně fagocytů jsou adhezní molekuly, které zajišťují přilnutí kendotelu cévní stěny. Rozpoznání cizorodé částice se děje prostřednictvím receptorů, které se váží přímo na struktury sdílené různými mikroorganizmy (např. Toll-like receptory, lektinové receptory), nebo nepřímo prostřednictvím protilátky nebo komplementu (receptor pro Fc-část protilátky, komplementové receptory).

Po pohlcení mikroorganizmu (nebo po aktivaci jinými podněty) se aktivuje systém enzymů, který zpracovává kyslíkovou molekulu na metabolity sbaktericidním (bakterie zabíjejícím) účinkem. Baktericidní účinek mají iněkteré součásti cytoplazmatických granul senzymatickou aktivitou (kationické proteiny, defenziny). Granula obsahují idalší proteo-lytické enzymy, které se účastní trávení pohlceného mikroorganizmu. Při rozsáhlém zánětu se mohou kyslíkové radikály aenzymy zgranulí dostat vně buňky apoškozovat okolní tkáně. Při zánětlivé reakci uvolňují fagocyty mediátory zánětu – produkty metabolizmu kyseliny arachidonové, tj. prostaglandiny, leukotrieny atromboxany. Tyto látky spolu scytokiny stimulují specifické složky imunity azpětně regulují rozsah zánětlivé reakce.

Výše zmíněné vlastnosti mají jak systém monocytomakrofágový, tak polymorfonukleární leukocyty. Vněkterých funkcích se liší: monocytomakrofágový systém je tvořen monocyty kolujícími vkrevním oběhu aznich se diferencují tkáňové makrofágy. Monocyty se diferencují také vdendritických buňkách. Vrůzných tkáních se buňky odvozené zmonocytů nazývají různými jmény: Langerhansovy buňky vkůži, Kupfferovy buňky vjátrech, alveolární makrofágy vplicích, peritoneální makrofágy vdutině břišní, oligodendroglie vcentrálním nervovém systému aj. Systém monocytomakrofágový má hlavní význam při zpracování apředkládání antigenů lymfocytům. To je jedním zkroků kvyvolání specifické imunitní reakce. Při aktivaci monocytů se produkují různé cytokiny, které aktivují specifické složky imunity azároveň zprostředkují celkovou reakci organizmu na přítomnost škodliviny, např. zvýšení teploty, produkci proteinů akutní fáze. Toto je účinek zejména interleukinu 1 a6 (IL-1, 6) afaktoru nekrotizujícího nádory (TNF). Lymfocyty T aktivované cytokiny (zejména interleukinem 12) pak zpětně produkcí interferonu gama aktivují makrofágy, které jsou pak schopny ničit pohlcené nitrobuněčné mikroby, jako např. mykobakteria, toxoplazmy aj. Aktivace makrofágu spočívá zejména vindukci syntázy oxidu dusnatého za vzniku tohoto baktericidního oxidu dusnatého.

Polymorfonukleární leukocyty cirkulují vkrevním oběhu, odkud mohou vycestovat. Mají krátký poločas života, kolem 12 hodin. Unormálního jedince jich je vkrvi přibližně 2–8 x 109/l. Fagocytózou jsou nadány neutrofilní aeozinofilní granulocyty. Neutrofilní granulocyty tvoří asi 40–60 % všech leukocytů, eozinofily asi 3 %. Neutrofilní granulocyty se uplatňují jako obránci první linie proti extracelulárním mikrobům, hlavně stafylokokům, kolibakteriím, pseudomonádám, ale iněkterým plísním (např. kandidám, aspergilům). Svými produkty aktivují další imunokompetentní buňky, podobně jako monocyty produkují zánětlivé cytokiny IL-1, IL-6 aj., které způsobí zvýšení teploty. Eozinofilní granulocyty se uplatňují zejména vobraně proti mnohobuněčným červům (parazitům) apři alergických reakcích.

1.2.1.2 Buňky NK

Buňky NK (přirození zabíječi) jsou lymfocyty, které nejsou ani T, ani B. Mají hrubá granula vcytoplazmě. Patří do systému nespecifické imunity. Podílejí se na zabíjení buněk infikovaných viry nebo nádorově změněných. Buňky NK rozeznávají cílové buňky, které neexprimují vlastní tkáňové molekuly slučitelnosti (tzv. MHC/HLA molekuly, viz dále). Pro tyto molekuly mají buňky NK receptory, které inhibují buněčné funkce. To znamená, že po rozpoznání buňky, která na svém povrchu nese HLA, se buňka NK neaktivuje. Pokud není HLA na cílové buňce přítomno, převáží stimulační receptory (např. Fc-receptory, lektinové receptory aj.) adojde kaktivaci buněk NK. Zcytoplazmy se uvolní granula obsahující perforiny, kterými ničí cílovou buňku tím, že ji „proděraví“ anavíc umožní průnik enzymů kaspás, které navodí vcílové buňce apoptózu. Charakteristickým znakem buněk NK jsou molekuly CD16 (receptor pro Fc-část protilátky pro IgG) aCD56.

1.2.1.3 Bazofily, žírné buňky adalší buňky

Vimunitní azánětlivé reakci hrají důležitou úlohu také bazofilní leukocyty ažírné buňky. Bazofily cirkulují vkrevním řečišti, obdobné žírné buňky sídlí převážně vpodslizniční tkáni. Pro bazofily ažírné buňky jsou typická granula, která obsahují histamin, serotonin, kininy apo aktivaci secernují produkty kyseliny arachidonové, leukotrieny, prostaglandiny adalší látky. Mají na svém povrchu navázané molekuly imunoglobulinu E, na které se může vázat antigen (alergen), tím dojde kdegranulaci auvolnění látek zgranulí, které působí projevy alergických reakcí.

Imunitních reakcí se účastní ibuňky, které přímo nepatří do složek imunitního systému. Příkladem jsou erytrocyty (podílejí se na vychytávání komplexů antigenu aprotilátky) atrombocyty (účastní se zánětlivých aalergických reakcí). Také fibroblasty, endotelie aepitelie produkují některé cytokiny aexprimují po aktivaci adhezní molekuly, které usnadňují průnik bílých krvinek do tkání.

1.2.2 Buněčná imunita specifická

Představiteli specifické buněčné imunity jsou lymfocyty T. Lymfocyty se vyvíjejí zlym-foidních předchůdců zkostní dřeně adozrávají vtymu (brzlíku). Dělí se podle funkcí na několik podskupin. Je možné je rozlišit pomocí membránových znaků (receptorů) označovaných jako CD. Pro všechny lymfocyty T jsou charakteristické znaky CD2 aCD3. Molekula CD3 je součástí receptoru pro antigen, tzv. TCR. Tento receptor váže antigen nabídnutý buňkou prezentující antigen ve spojení smolekulami systému HLA, zatímco molekuly CD2 aCD3 fungují jako adhezní asignalizační molekuly.

1.2.2.1 Lymfocyty T – pomahači

Podskupina lymfocytů T má na povrchu receptor označovaný CD4 amá zejména funkci tzv. pomahačů, helperů. Lymfocyty CD4+ rozpoznávají antigen, který jim předkládá buňka prezentující antigen spolu smolekulami hlavního histokompatibilního komplexu (HLA) II. třídy (viz dále), pro které je molekula CD4 receptorem. Tyto lymfocyty se po styku santigenem pod vlivem různých faktorů (nespecifických ispecifických složek imunity ajejich produktů) diferencují do funkčních podtypů označovaných Th1, Th2, Th3, Th17 aTreg. Tyto podskupiny se liší produkcí různého spektra cytokinů: pro Th1 je charakteristická produkce interferonu gama, pro Th2 interleukinů 4 a5, Th17 produkují interleu-kin 17. Th1 indukují imunitní reakci buněčného typu, Th2 převážně humorálního typu. Th3 aTreg produkcí zejména cytokinů IL-10 aTGF-beta (transformující růstový faktor beta) regulují rozsah imunitní reakce amají spíš tlumivý vliv na její rozvoj.

Receptor CD4 je zároveň receptorem pro virus HIV, který je původcem syndromu získané imunodeficience – AIDS, selhání imunity je zde dáno především poruchou funkce těchto lymfocytů, což se odrazí ve funkci celého imunitního systému.

1.2.2.2 Lymfocyty T – supresorově cytotoxické buňky

Druhá hlavní podskupina lymfocytů T má znak CD8. Tato subpopulace vykonává funkci cytotoxickou asupresorovou (tj. ničí infikované nebo nádorové buňky apotlačuje, reguluje imunitní reakci). Lymfocyty CD8+ rozpoznávají antigen spolu smolekulami hlavního histokompatibilního komplexu I. třídy (HLA I. třídy). Stejně jako upředchozí skupiny je receptorem pro antigen komplex TCR amolekula CD8 je receptorem pro část molekuly HLA I. třídy. Podobně jako CD4+ lymfocyty se ityto dělí do funkčních podskupin charakterizovaných produkcí rozličných cytokinů.

1.2.2.3 Paměťové buňky

Po prvním setkání antigenu simunitními mechanizmy zůstávají vorganizmu paměťové buňky, které při opakovaném setkání sním zajistí rychlejší aúčinnější imunitní odpověď. Za paměťové buňky jsou považovány lymfocyty T, nesoucí mj. znak CD45RO. Lymfocy-ty B sfunkcí paměťových buněk mají znaky CD19 aCD62L.

Tab. 2 Základní typy lymfocytů

hlavní

membránové znaky

hlavní intracelulární znaky nebo produkty

funkce

lymfocyty B

CD19, CD20

cytoplazmatické imunoglobulinové řetězce

diferenciace do plazmatických buněk produkujících protilátky

lymfocyty pomahači – typ Th1

CD3, CD4

IFN-γ

indukce buněčné imunity

lymfocyty pomahači –typ Th2

CD3, CD4

IL-4

indukce humorální imunity (spolupráce s lymfocyty B při produkci protilátek)

lymfocyty pomahači – typ Th3

CD3, CD4

TGF-β

regulace imunitní reakce, hojení, produkce vaziva, jizvení

lymfocyty pomahači – typ TH17

CD3,CD4

IL-17

aktivace neutrofilů, protibakteriální a protiplísňová aktivita

lymfocyty regulační – Treg

CD4, CD25

IL-10

regulace imunitní reakce, potlačení autoimunitních buněk

lymfocyty

cytotoxické

CD3, CD8

perforiny

cytolýza nádorových buněk nebo buněk infikovaných viry

paměťové buňky

CD3, CD4, CD45RO

imunologická paměť

1.3 Humorální složky imunity

Humorální imunita je zajišťována součástmi plazmy: protilátkami asystémem krevních bílkovin, které se nazývají komplement. Kromě toho je vséru celá řada dalších bílkovin, které se účastní vakutní fázi zánětu, nazývají se proto proteiny akutní fáze. Patří sem například CRP (C-reaktivní protein), MBL – lektin vázající manózu, sérový amyloid A, fibronektin aj.

Humorální imunita se uplatňuje vobraně proti extracelulárně se množícím opouzdřeným bakteriím (pneumokokům, streptokokům, Neisseriím aj.). Složky humorální imunity působí jako opsoniny, tj. látky, které vazbou na mikroba usnadňují jeho pohlcení fagocytujícími buňkami. Protilátky mají schopnost vázat komplement, který se tímto aktivuje azpůsobí rozpad mikroorganizmu, na nějž se naváže komplex protilátky akomplementu. Mikroorganizmus může být také zničen cytotoxickým lymfocytem nebo makrofágem. Protilátka zprostředkuje kontakt mezi těmito dvěma buňkami (tzv. reakce ADCC, buněčná cytotoxicita zprostředkovaná protilátkami). Látky toxické povahy mohou být protilátkami neutralizovány (např. očkováním proti tetanickému toxinu se navodí tvorba protilátek, které potom zabrání účinku toxinu produkovaného bakteriemi, jimiž se člověk může infikovat při poranění).

Složky humorální imunity se vyšetřují převážně ze srážlivé krve (ze séra), některé je možné stanovit ivplazmě.

1.3.1 Nespecifické složky humorální

1.3.1.1 Komplementový systém

Komplementem je nazýván systém plazmatických bílkovin produkovaných především jaterními buňkami, zmenší části makrofágy. Celkem je devět základních složek komplementu, označovaných C1–C9, adalších různých proteinů sregulačními funkcemi. Složky komplementu jsou přítomny vséru vneaktivní formě. Aktivují se různým způsobem, tzv. klasická cesta je spuštěna vazbou složky C1 na komplex protilátky santigenem. Obdobná je lektinová cesta, místo protilátky aktivuje složku C1 sérový lektin vázající manózu (MBL). Třetí cesta, tzv. alternativní, je vyvolána reakcí složky C3, např. senzymy uvolněnými zpoškozených tkání. Aktivace komplementu je kaskádou reakcí (podobnou procesu srážení krve), při kterých se aktivují další složky komplementu. Konečný komplex vazbou na membránu vytvoří póry azpůsobí tak rozpad buňky. Na každém stupni aktivace se zároveň spouští regulační pochody, které jsou zajišťovány inhibitory nebo inaktivátory (enzymy nebo vazebnými proteiny). Vlastní buňky organizmu jsou před účinkem komplementu chráněny zvláštními ochrannými molekulami. Vprůběhu kaskády aktivace komplementu vznikají štěpy jednotlivých součástí (označované písmeny a, b ...). Pro jednotlivé součásti komplementu existují na buňkách komplementové receptory. Funkce komplementu ajeho štěpů uvádí tabulka 3.

Tab. 3 Základní funkce komplementu

funkce

vykonávají složky

opsonizace (tj. vazba na mikroorganizmus, aby byl lépe pohlcen fagocyty)

C3b, C4b

chemotaxe (tj. pohyb buněk do místa zánětu ve směru koncentračního gradientu zánětlivých látek, chemotaxinů)

C3a, C5a, komplex C567

tvorba anafylatoxinů (tj. látek, které vyvolávají anafylaktickou reakci, tj. degranulaci žírných buněk, tvorbu histaminu, způsobují zvýšenou prospustnost cév)

C3a, C5a

zničení cílové buňky

membranolytický komplex C89

1.3.1.2 Proteiny akutní fáze

Důležitou složkou nespecifické imunity jsou tzv. proteiny akutní fáze. Jde oproteiny syntetizované játry vodpověď na aktivaci imunity infekčními ineinfekčními antigeny. Induktorem syntézy proteinů akutní fáze jaterními buňkami jsou prozánětlivé cytokiny, zejména IL-6. Za normálních okolností je koncentrace těchto proteinů nízká nebo ineměřitelná, při zánětu se zvyšují různou měrou. Druhá skupina proteinů se naopak při zánětu snižuje (např. albumin). Hlavním proteinem akutní fáze je C-reaktivní protein, CRP. Strukturálně patří do složitých molekul pentraxinů. Jeho fyziologickou funkcí je vazba na fragmenty DNA, která se při zánětu uvolňuje zpoškozených buněk. Dalšími proteiny akutní fáze jsou složky komplementu C3, C4, dále orosomukoid, alfa-2-makroglobulin, ceruloplazmin,alfa-1-antitrypsin. Mají různé funkce, fungují např. jako inhibitory proteáz nebo jako transportní proteiny. Proteiny jsou důležitou diagnostickou známkou zánětu. Nejvýraznější dynamiku má CRP. Na přítomnost zánětu reaguje vhodinách až stonásobným zvýšením koncentrace, monitorováním CRP tedy lze zachytit rozvoj zánětu, např. vpooperačním období. Nicméně jde omarker nespecifický, který se zvyšuje jak při zánětu infekčním, tak neinfekčním.

1.3.2 Specifické složky humorální

1.3.2.1 Protilátky

Protilátky jsou tvořeny plazmatickými buňkami, což je konečné stadium lymfocytů B. Lymfocyty B mají své označení od slova bursa, neboť uptáků existuje orgán zvaný Fabriciova bursa, ve kterém dozrávají lymfocyty B. Ulidí tento orgán neexistuje alymfocy-ty B zrají ve fetálních játrech, vkostní dřeni aslezině. Lymfocyty B mají na svém povrchu receptor pro antigen, který je tvořen částí imunoglobulinové molekuly. Spolu sdalšími přídatnými strukturami se celý komplex označuje jako BCR. Po setkání spříslušným antigenem se lymfocyt B začne dělit, až zněj vznikne klon plazmatických buněk, které produkují protilátky proti antigenu, který reakci vyvolal. Povrchové molekuly typické pro lymfocy-ty B jsou CD19 aCD20.

Protilátky jsou chemicky glykoproteiny, zvané imunoglobuliny. Mají strukturu molekuly uspořádané do tvaru Y. Rozvětvená část se nazývá variabilní ana ni se váže antigen. Variabilní část určuje specifitu protilátky, tj. proti jakému antigenu je namířena. Pro každý možný antigen existuje vorganizmu předem připravená protilátka navázaná jako vzorek na povrchu lymfocytu B. Tato ohromná různorodost vzniká vprůběhu zrání lymfocytů rekombinací na genové úrovni. Druhá část protilátky se nazývá konstantní (fragment Fc), podle ní se rozlišuje pět tříd (izotypů) imunoglobulinů: G, M, A, D aE. Částí Fc se protilátka váže na buňky, které mají pro ni receptor (granulocyty, buňky NK, makrofágy), apomáhá tak odstraňovat navázané cizorodé látky. Podélně se protilátka skládá ztěžkých řetězců (γ, µ, α, δ, ε) alehkých řetězců (ϰ, λ).

Jako první se vimunitní reakci tvoří izotyp IgM. Je to pentamer (pět molekul spojených vjeden celek), který účinně aktivuje komplement. Kprodukci tohoto izotypu nepotřebují lymfocyty B pomoc od lymfocytů T.

Vdalší fázi imunitní reakce se tvoří IgG po kontaktu lymfocytu B spříslušným lymfocytem T. Protilátky IgG mají vyšší schopnost vázat antigen apřetrvávají vorganizmu dlouhou dobu jako produkt paměťové imunitní reakce. Imunoglobuliny obsažené vséru představují sumu různých protilátek proti nejrůznějším antigenům, se kterými se jedinec setká vprůběhu života.

třída

21

1.3.2.2 Autoprotilátky

1.3.2.3 Monoklonální protilátky

1.4 Komunikace mezi složkami imunity

1.4.1 Cytokiny

1.4.2 Adhezivní molekuly

1.5 HLA systém

1.6 Fyziologická imunitní reakce

1.7 Patologické imunitní reakce

1.7.1 Atopická reakce – časná přecitlivělost, I. typ

1.7.2 Cytotoxická reakce, II. typ

1.7.3 Imunokomplexová reakce, III. typ

1.7.4 Reakce oddálené přecitlivělosti, IV. typ

1.8 Nemoci zporuch imunity

1.8.1 Imunodeficience

1.8.1.1 Primární imunodeficience

1.8.1.2 Sekundární imunodeficience

1.8.2 Autoimunitní onemocnění

1.8.2.1 Systémové autoimunitní choroby

1.8.2.2 Orgánově specifické autoimunitní choroby

1.8.3 Alergie