Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy

Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

MUDr. Pavel Klener jr., Ph.D., prof. MUDr. Pavel Klener, DrSc.

Principy systémové protinádorové léčby

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

Recenzenti:

Prof. MUDr. Bohuslav Melichar, Ph.D.

Prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

© Grada Publishing, a.s., 2013

Cover Design © Grada Publishing, a.s., 2013

Vydala Grada Publishing, a.s.

U Průhonu 22, 170 00  Praha 7

tel.: +420 234 264 401, fax: +420 234 264 400

www.grada.cz

jako svou 5345. publikaci

Odpovědná redaktorka Mgr. Jitka Straková

Sazba a zlom Antonín Plicka

Obrázky připravili MUDr. Pavel Klener jr., Ph.D. a Antonín Plicka.

Počet stran 200

1. vydání, Praha 2013

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a.s.

Autoři a nakladatelství děkují společnostem Roche s.r.o., Merck Sharp & Dohme s.r.o.,

Boehringer Ingelheim, spol. s r.o., Bristol-Myers Squibb spol. s r.o., Dialog Jessenius o.p.s., Bayer s.r.o.,

Egis Praha spol. s r.o., Novartis s.r.o., Česká asociace farmaceutických firem za podporu,

která umožnila vydání publikace.

Publikace byla podpořena granty PRVOUK P24/LF1/3, PRVOUK P27/LF1/1, SVV-2013-266509,

UNCE 204021, IGA MZ NT/13072-4.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-4171-0

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

E-knihu ve formátu EPUB vytvořil Antonín Plicka

ISBN 978-80-247-8842-5 (ve formátu PDF)

ISBN 978-80-247-8843-2 (ve formátu EPUB)

Předmluva

Předkládaná monografie navazuje na dřívější publikaci Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii (vydanou nakladatelstvím Grada Publishing v roce 2010), ale liší se svým zaměřením. Je orientována především na mechanismy účinku protinádorových léčiv v kontextu nových poznatků molekulární biologie. Používaná a nově zaváděná léčiva jsou zde sice zmiňována, ale bez bližších charakteristik jejich terapeutického využití, pouze s připomínkou hlavních indikací.

Do textu jsme zařadili několik „boxů“ přinášejících doplňkové údaje. Literární odkazy jsme omezili pouze na přehledová sdělení nebo zásadní publikace v renomovaných časopisech, které jsou zárukou validních informací.

Autoři děkují oběma recenzentům prof. RNDr. Blance Říhové, DrSc., z AV ČR a prof. MUDr. Bohuslavu Melicharovi z Univerzity Palackého v Olomouci za péči, kterou věnovali čtení rukopisu, a za cenné připomínky. Náš dík patří také pracovníkům nakladatelství Grada Publishing za vysoce profesionální redakční a technické zpracování publikace.

Praha, říjen 2013

autoři

1Úvod do problematiky nádorových onemocnění aprotinádorové léčby

Zhoubná nádorová onemocnění představují závažný celospolečenský problém. Ačkoliv paleoonkologické studie přinášejí svědectví ovýskytu zhoubných nádorů již vdobě prehistorické, teprve vminulém století se nádorová onemocnění dostala do popředí zájmu. Medicína se dříve logicky soustřeďovala na léčbu nejrůznějších závažných asmrtících onemocnění, zejména infekcí, atak se léčba nádorových onemocnění nacházela mimo hlavní zájem lékařů. Jedinou protinádorovou léčebnou metodou zůstávala až do dvacátých let 20. století léčba chirurgická, byť její možnosti byly značně omezené.

Zcela nový způsob protinádorové terapie představoval objev avyužití rentgenových paprsků. Jak chirurgická léčba, tak radioterapie se postupně zdokonalovaly. Pokroky voperační technice aanesteziologii umožňovaly stále odvážnější aradikálnější výkony, zlepšovala se iozařovací technika, postupně se zaváděly nové zdroje ionizujícího záření světší účinností na nádor asmenším rizikem poškození normálních tkání, postupně se zdokonalovaly též metody plánování radioterapie.

Teprve ve čtyřicátých letech minulého století lze pozorovat nesmělé začátky uplatnění nového léčebného přístupu, tj. chemoterapie. Byl to objev alkylačních látek (dusíkatý yperit) apozději antimetabolitů (metotrexát). Způvodně doplňkové metody se chemoterapie vprůběhu šedesátých let 20. století stala jednou zhlavních léčebných metod. Na rozdíl od dosavadních čistě lokoregionálních metod umožňovala chemoterapie systémový léčebný účinek.

Od sedmdesátých let 20. století se začalo ve větší míře uvažovat též oposílení protinádorové imunity vprotinádorové léčbě. Objevila se další léčebná disciplína – imunoterapie, nebo vširším smyslu tzv. biomodulační léčba.

Začaly se zveřejňovat iprvní příznivé zkušenosti se vzájemnou kombinací různých metod protinádorové léčby. Ukázalo se, že tzv. multimodální léčba má podstatně větší efektivitu než samostatně aplikované jednotlivé metody. Za mimořádný přínos lze považovat také postupné zdokonalování podpůrné adoplňkové léčby, která významně omezuje nebo izcela eliminuje nežádoucí účinky, jež aplikaci všech metod protinádorové léčby provázejí, což vedlo ke snížení mortality.

Pokroky molekulární biologie agenetiky vedly ke stále hlubšímu poznání mechanismů kancerogeneze apatofyziologie nádorových onemocnění. Sohledem na tyto poznatky byly izolovány či syntetizovány chemické sloučeniny, které cíleně blokují nitrobuněčné pochody aberantně aktivované unádorových buněk. Vznikla další nová disciplína – cílená terapie, jež se stala významnou součástí komplexní protinádorové léčby.

Dále se ukázalo, že růst nádoru není pouze výsledkem autonomní aneregulované proliferace, ale že velmi významným faktorem je též inhibice programované smrti buněk – apoptózy, která uněkterých typů nádorových onemocnění hraje dokonce významnější úlohu než vystupňovaná proliferace. Pro růst ašíření nádoru má mimořádný význam též indukce novotvorby cév – angiogeneze avaskulogeneze, schopnost vytvářet aberantní vztahy snenádorovými buňkami nádorového mikroprostředí aschopnost invazivního růstu a/nebo vytváření vzdálených metastáz. Protinádorové látky ovlivňující mikroprostředí se tak staly dalším obohacením léčebných možností.

Na nádor se přestalo pohlížet jako na masu homogenních nádorových buněk, které lze studovat aléčit per se, apozvolna se začal prosazovat náhled na tumor jako na vysoce komplexní onemocnění, které je vjasném vztahu (vztazích) k„nenádorovým“ složkám mikroprostředí (obr.1). Ukázalo se, že vlastní nádor je značně heterogenní soubor buněk. Později došlo kobjevu tzv.nádorových kmenových buněk, které jsou jako jediné zcelé nádorové tkáně nositeli nekonečné sebeobnovy (atedy nesmrtelnosti) nádoru. Tato poznání vedla ke hledání nových možných přístupů protinádorové léčby.

Rozluštění lidského genomu azdokonalování technologických postupů voblasti genetiky, molekulární biologie amakromolekulární chemie vedly ke vzniku biologické terapie, založené na podávání strukturálních analog přirozených makromolekul, nejčastěji proteinů (např. monoklonálních protilátek či rekombinantních lidských proteinů). Rozvoj genové terapie, nanotechnologie adalších disciplín otevírají další, zcela nové logistické, technologické ametodologické možnosti protinádorových strategií.

Obr.1 Redukcionistický vs. komplexní pohled na nádor

NB – nádorová buňka, ECM – extracelulární matrix, F – fibroblast, M – makrofág, DB – dendritická buňka, L – lymfocyt, C – céva

Vpředkládané monografii se budeme zabývat pouze metodami, které mají systémový účinek ado různé míry ovlivňují velmi komplexní pochody kancerogeneze apatobiologie nádorových onemocnění. Zatímco konvenční chemoterapií lze ovlivnit především proliferaci, replikaci aapoptózu nádorových buněk, cílená terapie může více či méně selektivně zasáhnout ido dalších deregulovaných procesů, jako je invazivita, metastazování, angiogeneze, sebeobnova, diferenciace aj.

1.1Nádorová tkáň anádorové mikroprostředí

Na nádor se až do nedávné minulosti pohlíželo jako na seskupení víceméně homogenních maligních buněk. Teprve poznatky posledních dvou dekád vedly kzásadní změně nazírání na maligní choroby, které se začaly zkoumat jako svého druhu „deregulované tkáně či orgány“, to znamená ve vztahu knádorovému mikroprostředí.

Zatímco parenchym nádoru je tvořen samotnými nádorovými buňkami, nádorové stroma se skládá jednak z„nenádorových“ buněčných komponent, jednak znebuněčných součástí. Je třeba zdůraznit, že nádorové stroma se může na složení nádoru podílet značně rozdílným způsobem. Zatímco difuzní velkobuněčný lymfom se obvykle skládá zvýrazné převahy parenchymu (tj.lymfomových buněk), uHodgkinova lymfomu mohou vlastní nádorové buňky (RS buňky) tvořit iméně než 1% nádorové masy. Apodobně – zatímco uchronické myeloidní leukemie jednoznačně převažuje podíl nádorového parenchymu (tj. masivní infiltrace kostní dřeně leukemickým klonem), vpatogenezi primární myelofibrózy hraje hlavní roli deregulace nádorového stromatu (fibrotizace mikroprostředí kostní dřeně). Analogicky jako učasové osy kancerogeneze ivpřípadě prostorového ohraničení bývá proto velmi obtížné určit přesné hranice nádoru ve smyslu „nádorového orgánu“, tedy vymezení, kde končí tkáň nádorová akde začíná tkáň „zdravá“.

Mezi „nenádorové“ buněčné komponenty nádorového mikroprostředí patří například snádorem asociované fibroblasty (cancer-associated fibroblasts – CAF), mezenchymové kmenové buňky (mesenchymal stem cells – MSC), endotelové buňky, pericyty ahladké svalové buňky cév, adipocyty nebo buňky imunitního systému: nádor infiltrující T-lymfocyty (tumor-infiltrating lymphocytes – TIL) či snádorem asociované makrofágy (tumor-associated macrophages – TAM). Nebuněčné komponenty nádorového mikroprostředí jsou tvořeny zejména extracelulární matrix (ECM) avní impregnovanými cytokiny, růstovými aangiogenními faktory adalšími bioaktivními molekulami produkovanými asekretovanými nádorovými anenádorovými buňkami mikroprostředí. Nádorové buňky, nenádorové buněčné složky aextracelulární matrix pak vytvářejí vlastní „tumor“ – deregulovaný orgán, vněmž jednotlivé komponenty nádorového mikroprostředí vstupují do vzájemných komplexních vztahů. Navíc zdaleka neplatí, že pouze nádorové buňky představují patologickou komponentu nádorové tkáně. Bylo prokázáno, že téměř všechny „nenádorové“ buněčné komponenty bývají menší či větší měrou deregulované, avdůsledku toho více či méně podporují, umožňují, či dokonce indukují přežití, růst ašíření nádorového parenchymu (tj. vlastních nádorových buněk).

Příkladem může být splenický lymfom, ukterého „prosté“ odstranění sleziny (splenektomie) vede vřadě případů knavození kompletní remise, tj. kvymizení lymfomových buněk zostatních kompartmentů (zkostní dřeně, periferní krve, event. infiltrovaných uzlin).

Každý, kdo se vlaboratorních podmínkách pokoušel vytvořit buněčnou linii zprimárních nádorových buněk, ví, že nádorové buňky in vitro velmi špatně proliferují adříve či později odumřou či diferencují. Nádorové buňky, které často nelze eradikovat vorganismu ani agresivní kombinovanou chemoimunoradioterapií, odumírají spontánně vokamžiku, kdy jsou odstřiženy od komplexních podpůrných stimulů nádorového mikroprostředí. Tento fakt jednak potvrzuje nezastupitelnou úlohu mikroprostředí, jednak vsobě skrývá obrovský potenciál molekulárních cílů, proti nimž lze teoreticky zasáhnout vrámci experimentální terapie nádoru za účelem co největšího ochromení aberantních vztahů mezi nádorovým parenchymem astromatem. Stroma karcinomu prsu je např. bohaté na fibroblasty amakrofágy, zatímco stroma normální prsní tkáně je na tyto buněčné typy chudé aobsahuje zejména adipocyty. Skarcinomem asociované fibroblasty produkují SDF1 (stroma-derived factor 1), parakrinní růstový faktor achemoatraktant pro nádorové buňky, které na svém povrchu exprimují receptor CXCR4/CD184. Snádorem asociované fibroblasty bývají ve srovnání s„normálními“ fibroblasty aktivované (tzv. myofibroblasty), čímž se podobají aktivovaným fibroblastům vmístě hojící se rány. Proto se zpatofyziologického hlediska tumory někdy označovaly jako „rány, které se nikdy nezhojí“.

Buňky imunitního systému velmi často místo toho, aby nádor eliminovaly, podporují jeho růst ainvazivitu sekrecí prozánětlivých či proangiogenních faktorů (např. TNF-α, GM-SCF, CSF1, IL4, IL6, SCF, VEGF, PDGF, MMP) nebo inhibují protinádorovou složku imunity produkcí imunosupresivních molekul (např. IL10, TGF-β, indolamin-2,3-dioxygenázy – IDO). Nádorové buňky mohou např. atrahovat makrofágy vdůsledku sekrece klíčového růstového faktoru monocytů CSF1 (colony-stimulating factor 1). Aktivované makrofágy (TAM – tumor-associated macrophages) pak působí mutagenně, neboť vmístě rostoucího nádoru produkují vysoké množství kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS). Kyslíkové radikály navíc účinně inhibují signalizaci zT-buněčného receptoru vdůsledku snížení exprese TCR-zeta řetězce. Makrofágy navíc produkují celou řadu cytokinů arůstových faktorů, které stimulují růst aproliferaci nádorových anenádorových buněk mikroprostředí (FGF, EGF, PDGF, HGF aj.). Bylo prokázáno, že bazofilní polymorfonukleáry stimulují růst CML blastů produkcí růstového faktoru HGF.

Hlavní populace imunosupresivních leukocytů, které klíčovým způsobem interferují sprotinádorovou imunitou, zahrnují regulační T-lymfocyty (regulatory T-cells – Tregs) amyeloidní supresorové buňky (myeloid-derived suppressor cells – MDSCs). Regulační T-lymfocyty (CD4+, CD25+, FOXP3+) inhibují nádor infiltrující cytotoxické T-lymfocyty (CD8+) jednak humorálně – produkcí imunosupresivních cytokinů (IL10, TGF-β), jednak kontaktně – expresí inhibičních molekul (CTLA4, PD-L1). Myeloidní supresorové buňky sekretují imunosupresivní molekuly, indukují populaci regulačních T-lymfocytů apřímo blokují funkci T-buněčných receptorů na nádor infiltrujících T-lymfocytech.

Komplexně deregulované jsou inádorem indukované novotvořené cévy (podrobně viz kap. 11.1.2). Stejně tak isložení extracelulární matrix nádorů, vytvářející jednak mezibuněčnou výplň stromatu, jednak bazální membrány oddělující epiteliální aendoteliální buňky od stromatu, vykazuje značné odchylky vporovnání se zdravými tkáněmi. Stroma solidních nádorů bývá výrazně tužší ve srovnání se zdravou tkání, za což je odpovědná např. zvýšená depozice kolagenu, změněná struktura kolagenních vláken a/nebo zvýšená aktivita lysyl-oxidázy (která vytváří zkřížené vazby mezi jednotlivými kolagenními vlákny).

Složení bazálních membrán epiteliálních karcinomů je také výrazně odlišné vporovnání se zdravými tkáněmi. Vzhledem ktomu, že složení bazálních membrán je odpovědné za řadu klíčových dějů, včetně ukotvení epiteliálních buněk na stroma, signalizaci do nitra buněk přes integrinové receptory či udržování polarity epitelu, má změna složení bazálních membrán komplexní dopad na celou řadu buněčných funkcí včetně ztráty polarity, zvýšení migračních alokomočních schopností až postupnou přeměnu zepiteliálního do mezenchymálního fenotypu (epithelial to mesenchymal transition – EMT). Změna složení ECM nádorového stromatu vede též ke komplexní změně vdistribuci cytokinů arůstových faktorů impregnovaných vmatrici.

Odhalení, že nádory nejsou tvořeny pouze nádorovými buňkami, vsobě skrývá zásadní dopad na koncipování nových přístupů protinádorové terapie, která může být zaměřena kromě samotných nádorových buněk též na „nenádorové“ komponenty. Příkladem vpraxi používané protinádorové terapie zaměřené proti „nenádorovým“ komponentám nádorového mikroprostředí může být antiangiogenní terapie (např. bevacizumab), imunomodulační monoklonální protilátky (anti-CTLA4, ipilimumab, anti-PD-1) nebo tzv. imunomodulační látky (IMID) – thalidomid, lenalidomid.

1.2Nádorové kmenové buňky ajejich hnízdo (niche)

Tkáňově specifické kmenové buňky (hematopoetické, jaterní, neuronální, kožní atd.) mají dvě vlastnosti, které je zásadním způsobem odlišují od ostatních buněk dané tkáně. Je to pluripotence aschopnost nekonečné sebeobnovy (tj. nesmrtelnost, imortalita). Schopnost nekonečné sebeobnovy teoreticky umožňuje vysokou pravděpodobnost vzniku mutací azároveň akumulaci různých mutací vtémže buněčném klonu během života jednotlivce. Nesmrtelnost představuje ijednu zhlavních charakteristik nádorových kmenových buněk.

Paradigma nádorových kmenových buněk předpokládá, že kmaligní transformaci dochází na úrovni normálních, tkáňově specifických kmenových buněk, jak je znázorněno na obrázku 2. Nádorové kmenové buňky jsou zodpovědné za udržení malignity vorganismu pacienta. Jejich asymetrickým dělením vznikají kromě dceřiných kmenových buněk také více či méně diferencované nádorové buňky, jejichž schopnost sebeobnovy je omezená acitlivost vůči terapii často vyšší vdůsledku zvýšené mitotické aktivity aztráty některých vlastností typických pro kmenové buňky (vyšší exprese anti-apoptotických molekul, efluxních kanálů či reparačních enzymů DNA aj.). Přežití nádorových kmenových buněk je zodpovědné za návrat choroby po jinak „úspěšné“ léčbě, kdy je dosaženo kompletní remise onemocnění (podle standardních vyšetřovacích algoritmů, tedy zejména pomocí CT či PET-CT kritérií).

Obr.2 Normální anádorová buněčná populace – vznik nádorových kmenových buněk maligní transformací normálních fyziologických protějšků ačasných progenitorů

Výzkum nádorových kmenových buněk dosáhl nejhlubších poznatků vhematoonkologii. Leukemická kmenová buňka vzniká znormální hematopoetické kmenové buňky ziskem minimálně dvou komplementárních mutací (obr.3). Velmi zjednodušeně lze konstatovat, že se jedná omutaci, která zablokuje diferenciaci, amutaci, která stimuluje proliferaci leukemických buněk. Leukemická populace je minimálně zpočátku onemocnění monoklonální (či maximálně oligoklonální), na rozdíl od silně polyklonální normální krvetvorby. Leukemická krvetvorba napodobuje normální krvetvorbu vtom, že je vertikálně hierarchizovaná. Na vrcholu pyramidy leukemické populace stojí nesmrtelné leukemické kmenové buňky (cca 1 : 10 000 až 1:1000 000leukemických buněk), které jako jediné jsou schopné udržovat nesmrtelný fenotyp tohoto maligního onemocnění. Leukemické kmenové buňky akutních myeloidních leukemií jsou charakterizovány specifickým imunofenotypem CD34+ CD38– CD90+ CD45RA–. Zbytek leukemické populace tvoří maligní buňky na různé úrovni diferenciace (leukemické blasty). Stupeň diferenciačního bloku leukemických blastů je vpřímé závislosti na typu mutovaného hematopoetického transkripčního faktoru.

Obr.3 Zjednodušené schéma leukemogeneze za účasti dvou komplementárních mutací

CML – chronická myeloidní leukemie, PV – polycythaemia vera, ET – esenciální trombocytemie, PMF – primární myelofibróza, AML – akutní myeloidní leukemie, MDS – myelodysplastický syndrom, MPN – myeloproliferativní neoplazmata, CMML – chronická myelomonocytární leukemie, RARS-T – refrakterní anemie sprstenčitými sideroblasty strombocytemií, RCUD – refrakterní cytopenie sunilineární dysplazií, RCMD – refrakterní cytopenie smultilineární dysplazií, RAEB – refrakterní anemie sexcesem blastů

Leukemické blasty na rozdíl od leukemických kmenových buněk nejsou nesmrtelné (nemají schopnost nekonečné sebeobnovy, nekonečný klonogenní potenciál), ačkoliv mívají vystupňovanou mitotickou aktivitu. Leukemické blasty tudíž po určitém počtu dělení zákonitě podléhají procesu stárnutí, apoptózy, nekrózy, autofagie či jiné buněčné smrti.

Cílená eradikace populace leukemických kmenových buněk by teoreticky vedla ke spontánnímu odumření „zbytkové“ leukemické populace. To má zásadní dopad na vývoj nových anti-leukemických terapeutických strategií.

Kromě leukemie byly nádorové kmenové buňky odhaleny ucelé řady solidních nádorů, jako je karcinom prsu, kolorektální karcinom, nádory CNS apod. Ačkoliv jejich morfologická identifikace bývá obvykle nemožná, byly odhaleny některé biochemické apovrchové markery preferenčně nacházené vpopulaci kmenových buněk určitých typů nádorových onemocnění. Markery kmenových buněk jsou uvedeny vtabulce 1.

Tab.1 Markery kmenových buněk

Nádorové onemocnění

Marker

karcinom prsu

CD44+ CD24– Lin– ALDH1+

nádory CNS

CD133+

maligní melanom

CD20+ ABCB5+

kolorektální karcinom

CD133+ CD44+ ALDH1+ EpCAM+

karcinom plic

CD24+ CD44+ CD133+

nádory hlavy akrku

CD44+ CD44+ CD133+ CD28+ CD29+

karcinom jater

CD133+ CD90+ CD44+

karcinom pankreatu

CD44+ CD24+ CD133+ aESA+

sarkomy

CD44+ CD105+ Stro1+

ALDH1 – aldehyde dehydrogenase 1, Lin – lineage, ESA – epithelial specific antigen, Stro1 – stromal marker 1

Pro nádorové kmenové buňky platí analogie toho, co bylo řečeno oleukemických kmenových buňkách. Nádorové kmenové buňky vznikají transformací svých fyziologických protějšků, tedy normálních, tkáňově specifických kmenových buněk. Vporovnání sdiferencujícími či diferencovanými nádorovými buňkami vykazují zvýšenou schopnost opravy DNA aobvykle se nacházejí vklidovém stavu (vG_0 fázi). Obě tyto vlastnosti vedou kvysoké rezistenci nádorových kmenových buněk vůči chemoterapii aradioterapii. Nádorové kmenové buňky jsou tedy nesmrtelné (mají schopnost nekonečné sebeobnovy), ale obvykle vykazují velmi nízkou mitotickou aktivitu. Naopak zbytková nádorová populace může mít vystupňovanou mitotickou aktivitu, schopnost nekonečné sebeobnovy však postrádá. Přežití nádorových kmenových buněk je nejčastější příčinou návratu (relapsu) maligního onemocnění po léčbě.

Normální kmenové buňky přežívají díky signálům mnoha podpůrných buněk, které vytvářejí specifickou topografickou tkáňovou jednotku složenou zkmenových buněk, podpůrných buněk aextracelulární matrix – tzv. hnízdo kmenových buněk (stem cell niche, zfranc. niche [niš] – hnízdo). Normální struktura zdravé tkáně vytváří podmínky pro existenci relativně malého počtu hnízd spřísně regulovaným počtem kmenových buněk. Vhnízdě jsou kmenové buňky vdůsledku exprese specifických povrchových molekul apříslušných receptorů topograficky soustředěny pouze do určitých míst, obvykle vpevné vazbě na podpůrné buňky, což umožňuje udržení polarity kmenových buněk, nezbytné pro jejich asymetrické dělení (zjedné kmenové buňky vznikají dvě dceřiné buňky, znichž jedna vstupuje do diferenciace, zatímco druhá zůstává kmenovou buňkou). Na architektuře hnízda kmenových buněk se významně podílí též správné složení extracelulární matrix abazálních membrán, které jsou odpovědné za optimální ukotvení kmenových buněk. Homeostáza kmenových buněk je regulována mimo jiné optimální tenzí kyslíku vhnízdě (tj. mírou hypoxie) ařadou parakrinně sekretovaných působků produkovaných podpůrnými buňkami.

Pro jeden typ kmenových buněk může existovat více typů hnízd. Například hematopoetická kmenová buňka přežívá minimálně ve dvou rozdílných hnízdech– jedná se otzv. endosteální niche (snízkou tenzí kyslíku, ve vazbě na osteoblasty) atzv. perivaskulární niche (svysokou tenzí kyslíku, ve vazbě na endoteliální buňky). Ukotvení krvetvorných kmenových buněk (hematopoetic stem cells – HSC) na podpůrné buňky (osteoblasty, endotelie) umožňuje udržení polarity HSC aje podkladem pro asymetrické dělení HSC.

Deregulace nádorového mikroprostředí (tj. „nenádorových“ buněčných komponent, ale též změny ve složení ECM či změny vtenzi kyslíku) mohou vytvářet permisivní hnízdo pro přežití, proliferaci ašíření nádorových kmenových buněk. Abnormální produkce proteáz (např. plazminu či MMP) vede postupně kremodelaci mikroprostředí včetně narušení bazálních membrán abuněčných interakcí (cell-cell interactions), které jsou nahrazeny interakcemi buňka-stroma (cell-stroma interactions), změněnou aktivací přes integrinové receptory azměněnou motilitou buněk. Vzniká hnízdo nádorových kmenových buněk.

1.3Nádor jako důsledek genetické aepigenetické deregulace

Vznik nádorového onemocnění je složitý vícestupňový proces, během něhož se normální buňka mění akumulací řady klíčových genetických aepigenetických mutací na buňku nádorovou.

Genetické mutace (bodové mutace, chromozomální translokace apod.) mění primární strukturu DNA (tj. kód daný sekvencí nukleových bází) konkrétních genů či mikroRNA (miR), což obvykle vede ke strukturálnímu afunkčnímu narušení příslušných proteinů (vpřípadě mutace genů) nebo ke změněné expresi cílových proteinů (vpřípadě mutace miR).

Epigenetické mutace vedou knarušení sekundární (epigenetické) struktury DNA. Epigenetická struktura DNA je dána posttranslační úpravou histonů a/nebo DNA, zchemického hlediska se nejčastěji jedná oacetylaci ametylaci (ikdyž existují ijiné formy posttranslační úpravy, např. ubikvitinace, sumoylizace, citrulinace aj.). Vzhledem ktomu, že acetylace/deacetylace histonů hraje vsekundárním uspořádání DNA hlavní roli, hovoří se někdy otzv. histonovém kódu (jako doplňku ke genetickému kódu danému sledem nukleových bází). Výsledkem je změna prostorového uspořádání DNA (zheterochromatinu na euchromatin či naopak) astím spojená změna exprese příslušných genů či miR.

Unádorových onemocnění může docházet kutlumení exprese klíčových transkripčních faktorů či tumor supresorových genů, nebo naopak kobnovení exprese genů či miR, které nejsou vdospělém organismu za normálních podmínek exprimovány (např. geny účastnící se procesu embryogeneze apod.). Bylo prokázáno, že usolidních nádorů dochází vprůběhu kancerogeneze knahromadění vprůměru šesti až osmi kritických mutací. Uhematologických malignit je situace mírně odlišná, uakutních leukemií je třeba zisk minimálně dvou kritických mutací. Neznamená to ovšem, že vleukemických či nádorových buňkách nalezneme pouze výše zmíněný počet mutací – leukemické anádorové buňky vykazují vdobě diagnózy nádorového onemocnění obvykle stovky až tisíce různých genetických aepigenetických změn, nicméně většinu znich tvoří tzv. sekundární mutace, které vznikají následkem zvýšené genetické nestability nádorových buněk ana procesu kancerogeneze se pravděpodobně aktivně nepodílejí. Pouze některé mutace představují tzv. kritické mutace, které jsou přímým podkladem maligní transformace nádorových buněk. Mezi kritické mutace patří např. aktivace onkogenů, inaktivace tumor supresorových genů, zvýšení exprese inhibitorů apoptózy, mutace genů řídících průchod buněčným cyklem apod.

Vprůběhu kancerogeneze postupně premaligní apozději maligní klon kooptuje celou řadu nenádorových buněk mikroprostředí včetně buněk imunitního systému, které následně usnadňují přežití, růst ašíření nádoru vorganismu ametastazování lymfatickou či krevní cestou. Plně maligní metastatický kolorektální karcinom nevznikne během dnů či týdnů, ale ke kumulaci kritických mutací dochází obvykle vprůběhu řady let. Přesně určit časový bod, kdy se ze zdravé sliznice tlustého střeva stává „nádor“, není možné. Poslední mezistupeň kancerogeneze, ze kterého je progrese do plně maligní formy již pouze otázkou času, označujeme jako prekancerózu (např. vilózní adenom jako prekanceróza kolorektálního karcinomu). Uprekancerózy dosáhla deregulace homeostázy následkem akumulace kritických mutací již takového stupně, že samotný proces kancerogeneze už nelze zastavit. Schematicky je postupný vznik nádorového onemocnění znázorněn na obrázku 4.

Obr.4 Schéma vícestupňového procesu kancerogeneze

Proces kancerogeneze je možno ještě zpomalit či zastavit jedině vjeho iniciálních etapách (iniciace apromoce) některými chemopreventivními přípravky. Nicméně již iniciace představuje nevratný proces počátečních genetických změn, vjejichž důsledku mohou iniciované buňky přežívat vmorfologicky „zdravých“ tkáních celé roky. Iniciované buňky pak mohou být vystaveny promoci vsouvislosti se setkáním schemickými kancerogeny, ionizujícím zářením či svlivem probíhajícího zánětlivého procesu. Vprůběhu promoce obvykle dochází kakcentaci buněčné proliferace akpotlačení apoptózy aoprav DNA, což usnadní vznik dalších genetických aepigenetických změn. Vpřípadě prekancerózy jde již onevratné směřování do plně maligního fenotypu.

Plně maligní klon dává svým dělením vzniknout nádorové populaci, vníž od počátku probíhá klonální divergence vlivem různých selekčních tlaků. Selekční tlaky působí jednak zevnitř nádorové populace – genetickou nestabilitou nádorových buněk azní plynoucí akumulací genetických mutací (agresivnější klony tak postupně vytlačují původní nádorový klon), jednak zvnějšku – například vlivem protinádorové imunity či účinkem protinádorové terapie (klony rezistentní kléčbě postupně přerůstají původně citlivé nádorové buňky).

Nádorové onemocnění má tudíž vnaprosté většině případů tendenci kpostupnému zvyšování agresivity. Proto hlavní léčebnou strategií uvětšiny malignit zůstává co nečasnější eradikace maligního klonu. Kompletní eliminaci nádorových buněk však obvykle komplikuje systémová diseminace či metastatický rozsev nádoru. Avšak itakové komplexní procesy, jako je novotvorba cév či tvorba vzdálených metastáz, představují vlastnosti, které nádorová buňka (či lépe nádorová tkáň) získává vprůběhu progrese nádoru (nejedná se ovlastnosti, které by nádorové buňky měly od samého počátku).

1.4Nádor jako důsledek selhání imunologického dohledu

Možnou roli (selhání) imunitního systému při vzniku ašíření nádorů předpokládal již Paul Ehrlich vroce 1909, ale vědecká hypotéza imunologického dohledu nad nádory (cancer immune surveillance) byla postulována až vpadesátých letech 20. století Burnettem aThomasem. Vdalších dekádách byl vliv imunitního systému na vývoj nádorových onemocnění postupně zpochybňován, renesance zájmu oimunitní systém ve vztahu ke vzniku avývoji nádorů nastala až vdevadesátých letech 20. století, kdy bylo experimentálně prokázáno (zejména pomocí myších knock-out modelů), že vyřazení klíčových hráčů či regulátorů vrozené či získané imunity (např. perforinu, IFN-γ, STAT1, RAG2 aj.) je asociováno se zvýšenou tvorbou spontánních či chemicky indukovaných nádorů. Dalším důkazem pak byla zvýšená incidence některých typů nádorových onemocnění uimunokompromitovaných pacientů, např. pacientů po orgánových transplantacích či pacientů sAIDS. Poslední dvě dekády intenzivního výzkumu vimunologii nicméně přinesly důkazy pro duální roli imunitního systému vprůběhu kancerogeneze. Imunitní systém může na jedné straně přispívat keliminaci nově transformovaných buněk nebo keradikaci zbytkové nádorové populace po léčbě, na druhou stranu byla vmnoha případech jasně demonstrována podpůrná role imunitního systému při přežití, růstu či šíření celé řady nádorů.

Předpokládá se, že hlavní roli vprotinádorové imunitě hrají cytotoxické T-lymfocyty. Alogenní transplantace kostní dřeně za použití T-depletovaných štěpů byly spojeny se signifikantně vyšším rizikem relapsu akutní myeloidní leukemie ve srovnání stransplantacemi za použití štěpů, které T-lymfocyty obsahovaly.

Základním dogmatem protinádorové imunity je existence nádorových antigenů. První důkazy ojejich existence byly podány všedesátých letech minulého století, kdy bylo experimentálně prokázáno, že imunizace imunokompetentních myší chemicky indukovanými nádory chrání tyto myši před vznikem stejných typů (chemicky indukovaných) nádorů.

Následné zjištění, že nádory formované vimunokompetentních myších jsou kvalitativně odlišné (neimunogenní) ve srovnání se stejnými typy nádorů formovaných vimunodeficitních myších (imunogenní), vedlo kpostulaci hypotézy tzv. editace nádoru imunitním systémem (cancer immunoediting). Tato hypotéza předpokládá tři vzájemně provázané fáze: eliminaci, ekvilibrium aúnik nádoru (obr.5). Vprvní fázi tzv. eliminace dochází kaktivnímu ničení nádorových buněk složkami imunitního systému. Vpřípadě, že některé nádorové buňky uniknou imunologickému dohledu, dochází kposunu do druhé (různě dlouhé) fáze– tzv.ekvilibria (rovnováhy), kdy imunitní systém aktivně brání růstu a/nebo šíření nádoru, ale již není schopen nádorové buňky zcela eradikovat. Fáze ekvilibria byla experimentálně prokázána umyšek schemicky indukovanými sarkomy, ukterých byla latence růstu makroskopických nádorů významně zkrácena podáním monoklonálních protilátek eliminujících myší T-lymfocyty (tedy vyřazením specifické imunity). Nádorové buňky izolované znásledně formovaných tumorů byly navíc vysoce imunogenní, čímž připomínaly nádory vzniklé vimunodeficitních myškách. Vpřípadě selhání ekvilibria dochází krozvoji třetí fáze – tzv.úniku nádorových buněk, akna něj navazujícímu růstu ašíření nádoru vorganismu. Kúniku nádorových buněk před imunitním systémem může docházet rozličnými mechanismy, které však lze obecně rozdělit do dvou velkých skupin:

1. 1.mechanismy vycházející znitra nádorových buněk neboli intrinzický únik („kamufláž“), kam patří např. ztráta exprese tumor specifických antigenů; ztráta exprese MHC gp I. třídy už znamená ztrátu molekul, které zajišťují prezentaci nádorového antigenu na povrchu nádorových buněk;

2. 2.mechanismy vycházející zmikroprostředí nádoru neboli extrinzický únik („sabotáž“), kam řadíme např. sekreci imunosupresivních cytokinů amolekul (IL10, TGF-β, VEGF, indolamin-2,3-dioxygenáza) či zmnožení populací imunosupresivních leukocytů (např. regulační T-lymfocyty – Tregs), myeloidních imunosupresivních buněk (MDSC), nezralých dendritických buněk (iDC) aj. (viz dále kap. 7 Imunoterapie).

Pochopení významu imunitního systému pro přežití arůst nádoru se odrazilo vnových terapeutických přístupech vléčbě nádorů, ať už se jedná oaplikaci monoklonálních protilátek proti nádorovým antigenům (CD20 uB-lymfomů, HER2 ukarcinomu prsu), adoptivní transfer tumor specifických cytotoxických T-lymfocytů (expandovaných in vitro, případně geneticky modifikovaných), aktivní imunizaci pomocí nádorových vakcín, či omodulaci nádorového mikroprostředí (např. monoklonální protilátky proti CTLA-4 či PD-1).

Obr.5 Imunologický dohled nad nádory amechanismy jeho selhání – immune escape (volně podle Schreiber etal. Science, 2011; 331: 1565)

PD-L – programmed death (programová smrt), MDSC – myeloid-derived suppressor cells (myeloidní supresorové buňky), T-regs – regulatory T-cells (regulační T-lymfocyty), CTLA-4 – cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4, IDO–indolamin-2,3-dioxygenáza

1.5Nádor jako důsledek chronického zánětu či infekce

Zatímco akutní zánět vede keliminaci patogenu achrání organismus před poškozením včetně nádorové transformace (vpřípadě celé řady virových infekcí), chronický zánět přispívá ke kancerogenezi na všech jejích úrovních. Podporuje iniciaci nádoru navozením chronického genotoxického stresu, podporuje promoci nádoru následkem stimulace buněčné proliferace apřispívá kprogresi nádoru indukcí novotvorby cév apodporou migrace ainvazivity. Chronický zánět (tj. imunitní složka nádoru podporující jeho vznik anásledný růst) aimunologický dohled (tj. imunitní složka inhibující vznik, růst ašíření nádoru) mohou velmi pravděpodobně koexistovat ivrámci jedné konkrétní nádorové léze avytvářet provázaný komplex vzájemně protichůdných vztahů.

1.5.1Fyziologické aspekty zánětlivé reakce

Již vroce 1863dával Wirchow vznik nádorových onemocnění do souvislosti sprobíhajícím zánětem. Na tomto místě je vhodné si stručně připomenout jednotlivé fáze zánětlivé odpovědi.

Vnávaznosti na poranění či infekci dochází ke komplexní odpovědi organismu, která má za cíl zhojení poškozené či infikované tkáně. Ta zahrnuje především lokální depozici fibrinové zátky abolusu celé řady bioaktivních molekul následkem degranulace trombocytů, vystupňované koagulace aaktivace komplementu vmístě poškozené tkáně či probíhající infekce (leukotrieny, C3a, C5a, trombin, serotonin, heparin, faktorV, fibrinogen, von Willebrandův faktor, PDGF, bFGF, TGF-α, TGF-β aj.). Následkem působení cytokinů achemoatraktantů dochází kaktivaci žírných buněk atkáňových makrofágů vmístě poškození akaktivaci atransmigraci leukocytů (neutrofilů, monocytů, eozinofilů) do místa poškození.

Aktivace žírných buněk – např. vazbou meziproduktů aktivace komplementu (C3a C5a) na specifické receptory – má za následek degranulaci histaminu, serinových proteáz, tryptázy, proangiogenních molekul (bFGF), MMP adalších klíčových molekul vmístě zánětu či infekce. Aktivace leukocytů zahrnuje aktivaci selektinů aintegrinů, imobilizaci anáslednou extravazaci leukocytů do místa zánětu. Vcestovalé neutrofily amakrofágy fagocytují bakterie aprodukují kyslíkové adusíkové radikály (reactive oxygen species – ROS, reactive nitrogen species – NOS), které mohou působit genotoxicky (mutagenně). Vcestovalé monocyty se mění vtkáňové makrofágy ajsou producenty mnoha klíčových cytokinů, včetně TNF-α, IL1, TGF-β, PDGF, bFGF, IGF-1 aIGF-2. Cytokiny produkované aktivovanými makrofágy mění vlastnosti dalších buněčných typů, včetně endotelových, mezenchymových či epitelových buněk ahlavní měrou ovlivňují výslednou remodelaci hojící se tkáně, včetně její neovaskularizace. Aktivace fibroblastů vmístě zánětu vede kakcentaci sekrece extracelulární matrix, která vytváří stroma granulační tkáně. Aktivované fibroblasty následně působí kontraktilně ahlavní měrou se podílejí na uzavření rány atvorbě jizvy. Posledním krokem při hojení rány je reepitelizace.

1.5.2Zánět anádorová onemocnění

Předpokládá se, že až 15% všech nádorových onemocnění vzniká vmístě chronické infekce či zánětu. Delece či mutace TP53lze detekovat svysokou frekvencí umnoha chronických zánětlivých chorob, jako je revmatoidní artritida či nespecifické záněty střeva. Kolorektální karcinom vzniká často vterénu nespecifických zánětů střev (ulecrózní kolitidy či Crohnovy nemoci), hepatocelulární karcinom vzniká na podkladě chronické hepatitidy B aC, karcinom močového měchýře uschistosomiázy akarcinom či lymfom žaludku na podkladě chronické gastritidy vyvolané Helicobacter pylori. Eradikace této bakterie, která je odpovědná za chronickou gastritidu, vede učasných stadií MALT lymfomu žaludku ke spontánní involuci lymfomu (následkem odstranění stimulačního efektu chronicky probíhajícího zánětu) bez nutnosti podávání systémové chemoterapie.

Další důkaz poukazující na význam zánětu vprůběhu nádorové transformace pochází zepidemiologických metaanalýz pacientů dlouhodobě užívajících nesteroidní protizánětlivé léky (non-steroid anti-inflammatory drugs – NSAID). Prokázalo se, že dlouhodobé užívání NSAID snižuje pravděpodobnost vzniku některých nádorů až o50% (kolorektální karcinom, karcinom plic, karcinom žaludku).

Molekulární podstata stimulačního efektu probíhajícího zánětu na proces nádorové transformace či progrese je předmětem intenzivního zkoumání. Bylo prokázáno, že nádorové buňky produkují spektrum cytokinů, chemokinů arůstových faktorů, které působí chemotaxi aaktivaci leukocytů (lymfocytů, monocytů, neutrofilů, eozinofilů, žírných buněk) do místa nádoru. Aktivované makrofágy produkují širokou škálu proangiogenních alymfangiogenních molekul amohou působit imunosupresivně (např. produkcí IL10). Makrofágy také obvykle vylučují cytokiny, které parakrinně působí na nádorové buňky apozitivně tím ovlivňují jejich přežití, proliferaci amigrační schopnosti (šíření nádoru). Například buňky melanomu mohou pod vlivem cytokinů arůstových faktorů produkovaných aktivovanými makrofágy sekretovat do okolí řadu biomolekul, včetně IL8 aVEGFA, čímž dochází kparakrinní stimulaci angiogeneze. Aktivní působky produkované aktivovanými makrofágy ovlivňují nejen nádorové buňky, ale také „nenádorové“ buněčné komponenty mikroprostředí, včetně endotelových buněk, mezenchymových kmenových buněk či T-lymfocytů. Postupně tak vnádorové tkáni dochází ke komplexní remodelaci nádorového stromatu, které se stává zvýšeně permisivní kdalšímu růstu ašíření nádoru. Nádorové stroma plně vyvinutého tumoru může dokonce samo osobě působit jako induktor či promotor kancerogeneze apodporovat např. transformaci zbylých normálních tkáňových kmenových buněk na buňky nádorové. Uzavírá se bludný kruh komplexních patologických vztahů mezi nádorovými anenádorovými buňkami.

1.6Lymfoproliferativní choroby jako důsledek deregulace specifické imunity

Lymfocyty (B-lymocyty aT-lymfocyty) jako jediné buňky vorganismu exprimují na svém povrchu vysoce specifické povrchové receptory schopné vázat antigen – tzv. imunokompetentní receptory: B-buněčný receptor (BCR) aT-buněčný receptor (TCR). Díky tomu jsou lymfocyty nositeli avykonavateli tzv. získané (adaptivní, specifické) imunity.

Vývoj lymfocytů je poměrně složitý, probíhá vkostní dřeni, primárních lymfatických orgánech – kostní dřeň, thymus, asekundárních lymfatických orgánech – uzliny, slezina, tonzily, Peyerské pláty střeva adalší slizniční lymfatická tkáň – MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) (obr.6A, B).

Vkostní dřeni dochází kvývoji pro-lymfocytu zkrvetvorné kmenové buňky. Vprůběhu diferenciace lymfoidních progenitorů dochází postupně kvytvoření anásledné povrchové expresi BCR aTCR receptorů. Je třeba si uvědomit, že jednotlivé receptory BCR (tj.imunoglobulinové receptory třídy IgM či IgD) aTCR nejsou kódovány jednotlivými geny, ale tzv. moduly označovanými V(variable), D (diversity) aJ(joining). V-D-J úseky DNA podléhají během vývoje lymfocytu vkostní dřeni tzv. rekombinaci, kdy rozstřižením anásledným spojením DNA pomocí enzymů RAG1 aRAG2 (recombinase activating genes) vznikají (zcela náhodně) různé výsledné molekuly povrchových imunoreceptorů (obr.7). Vzhledem ktomu, že se jedná onáhodný proces, může při rekombinaci docházet kvytvoření takových molekul DNA, které nelze přepsat do výsledného proteinu (tzv. neproduktivní rekombinace). Na druhou stranu mohou vznikat takové imunokompetentní receptory, které silně vážou vlastní antigeny (tzv.autoreaktivní klony).

Aby nedocházelo kzahlcení organismu nereaktivními a/nebo autoreaktivními klony, musejí být takové klony eliminovány. Hlavní roli vtomto procesu hraje thymus. Vzhledem ktomu, že imunokompetentní receptory mají klíčový vliv na přežití lymfocytů, jsou nereaktivní klony sneproduktivní rekombinací BCR či TCR odsouzeny kapoptóze. Klony spříliš silnou afinitou kvlastním antigenům (autoreaktivní klony) jsou vthymu likvidovány (tzv. negativní selekce), ado organismu se tudíž dostávají pouze lymfocytární klony sfunkčním imunokompetentním receptorem, které vykazují slabou afinitu kvlastním tkáňovým antigenům (tzv. pozitivní selekce) (viz obr.6B).

Obr.6 Vývoj lymfocytů avznik lymfoproliferativních chorob:

A– vývoj B-lymfocytu

B – vývoj T-lymfocytu

MHC – major histocompatibility complex, BCR – B-cell receptor, TCR – T-cell receptor, T-AAL – akutní lymfoblastická leukemie, LBL – lymfoblastický lymfom, PTCL – periferní T-lymfom

Pozitivní selekce B-buněk aT-buněk je trochu odlišná. Pozitivní selekce T-buněk zaručuje, že dále budou vyzrávat jen ty T-lymfocyty, jejichž receptory rozpoznávají nejen vlastní MHC (ulidí HLA) molekuly, ale že také exprimují příslušné koreceptory (CD8 pro MHC gp I. třídy aCD4 pro MHC gp II. třídy). UB-linie vybírá pozitivní selekce takové buňky, které exprimují BCR. Principy negativní selekce jsou podobné uT- iB-linií – dochází při ní keliminaci těch buněk, které vážou příliš silné vlastní antigeny.

Slabá signalizace zBCR či TCR do nitra buňky je nezbytná pro přežití lymfocytu vorganismu. Tyto lymfocyty se označují jako tzv. naivní lymfocyty. Naivní lymfocyty následně recirkulují mezi krví asekundárními lymfatickými orgány. Vsekundárních lymfatických orgánech (např. uzlině) lymfocyty rolují po výběžcích folikulárních dendritických buněk, které vystavují na svých výběžcích nejrůznější exoantigeny, dopravené do uzliny tzv. antigen prezentujícími buňkami (např.monocyty) ze spádové oblasti dané uzliny. Vpřípadě, že se imunokompetentní receptor lymfocytu naváže na antigen vystavený např. vlymfatické uzlině, je daný lymfocyt vuzlině zadržen aprodělává další složitý vývoj, na jehož konci stojí zralá imunokompetentní buňka– cytotoxický T-lymfocyt nebo plazmatická buňka sekretující imunoglobuliny.

Vprůběhu diferenciace znaivního lymfocytu do imunokompetentní buňky dochází kněkolika komplexním dějům, které vysoce inklinují kmutagenezi (atedy klymfomagenezi). Jednak dochází vuzlině ke klonální expanzi při vytváření tzv. zárodečného centra (germinal center reaction), kdy způvodně jednoho či několika lymfocytárních klonů vzniká „armáda“ stovek milionů či miliard imunokompetentních buněk. Klonální expanze je provázena vystupňovanou mitogenní aktivitou, která sama osobě predisponuje ke vzniku náhodných chyb při přepisu DNA. Při klonální expanzi probíhá navíc diferenciace, při níž se komplexním způsobem mění genová exprese lymfocytu. Je nutné zdůraznit, že klonální expanze není pouhým „množením“ buněk, ale je provázena cíleným zvyšováním afinity imunokompetentních receptorů kantigenu aplánovanou změnou fenotypu lymfocytů.

Za zvyšování afinity TCR či BCR kantigenu je zodpovědný děj, který označujeme jako tzv. somatickou hypermutaci. Během ní dochází pomocí enzymu AID (activation-induced cytidine deaminase) kcílené bodové mutaci variabilních úseků BCR aTCR, které vážou antigen. Somatická hypermutace tudíž náhodným způsobem buď zvyšuje, nebo snižuje afinitu BCR či TCR kantigenu. Pouze takové lymfocytární klony, unichž dojde ke zvýšení afinity, jsou stimulovány kdalší mitóze. Ostatní klony hynou vprůběhu klonální expanze procesem apoptózy. Vpřípadě B-lymfocytů dochází vzávěru diferenciace ještě ktzv. izotypovému přepnutí těžkých řetězců pro molekuly imunoglobulinu, vdůsledku čehož se mění izotyp produkovaných molekul imunoglobulinu (nejčastěji znízkoafinitních IgM na vysokoafinitní IgG).

Obr.7 Rekombinace DNA avznik imunoglobulinového receptoru

segmenty zárodečné DNA kódující imunoglobulinové receptory: V– variable, D – diversity, J – joining, C – constant; RAG–recombinase-activating genes, TdT – terminal deoxynucleotidyl-transferase, AID – activation-induced cytidine-deaminase, Ig – imunoglobulin, Fab – fragment vázající antigen, Fc – konstantní fragment

Podobně jako rekombinace DNA (vprůběhu raného vývoje lymfocytu vkostní dřeni), také somatická hypermutace aizotypové přepnutí těžkých řetězců (vlymfatické uzlině) jsou spojeny smanipulací sDNA. Jakýkoliv zásah do DNA je vždy spojen srizikem její mutace. Chybná aplikace somatické hypermutace může mít za následek somatickou mutaci buněčných onkogenů, např. transkripčního faktoru MYC. Chybná aplikace rekombinace DNA (enzymy RAG1/RAG2) či izotypového přepnutí těžkých řetězců (enzymem AID) může mít za následek vznik chromozomové translokace. Vpřípadě lymfomů se nejčastěji jedná otzv. juxtapozice, kdy se nemutované geny (transkripčních faktorů, antiapoptotických genů apod.) dostávají pod vliv zesilovačů transkripce imunoglobulinových molekul či T-buněčných receptorů. Klasickým příkladem translokace nalézané ulymfomů je zvýšená exprese antiapoptotického genu BCL2 (B-cell lymphoma 2) ufolikulárního lymfomu následkem translokace t(14;18), zvýšené exprese transkripčního faktoru MYC uBurkittova lymfomu následkem translokace t(8;14) nebo zvýšené exprese cyklinu D1 ulymfomu zplášťových buněk následkem translokace t(11;14).

Lymfoproliferace tudíž vznikají jako přímý důsledek chyb vprůběhu složitého procesu adaptivní imunitní odpovědi avznik celé řady lymfomů byl také jednoznačně asociován schronicky probíhajícími záněty (chronická gastritida, chronický zánět střev, chronická sialoadenitida aj.).

1.7Apoptóza ajejí regulace

Apoptóza anekróza představují dva základní vzájemně odlišné mechanismy buněčného zániku.

Nekróza je živelný proces nekontrolované buněčné dezintegrace vdůsledku výrazných ireverzibilních zásahů, obvykle zvnějšku buňky (tepelný šok, osmotický šok apod.). Nekróza vede knekontrolovanému rozpadu buňky aje následována výraznou zánětlivou reakcí.

Apoptóza (zřeckého apoptosis – opadávání listí), programová buněčná smrt, je naproti tomu aktivní, do jisté míry reverzibilní, proces vyžadující ATP. Apoptóza obvykle nevede krozvoji zánětlivé reakce. Je to zcela nezbytný, evolučně velmi starý mechanismus, který vede křízené eliminaci přestárlých, nefunkčních, nepotřebných, mutovaných, infikovaných či transformovaných buněk. Normální fungování apoptózy je nutné pro zdárný průběh embryogeneze apro udržení homeostázy vpostnatálním období.

Na rozdíl od nekrózy je apoptóza neimunogenní proces. Vnádorové imunologii byl ale zaveden pojem imunogenní apoptóza, který vysvětluje, proč apoptotické nádorové buňky vyvolávají imunitní reakci. Celý proces je poněkud složitý. Nádorová buňka vlivem stresu (např. po antracyklinových antibiotikách) translokuje kalretikulin zendoplazmatického retikula na povrch. Taková buňka je pak rozeznávána „scavenger“ receptory vdendritických buňkách jako potenciálně nebezpečná aje fagocytována. Umírající nádorová buňka ještě vysílá signály, tzv. alarminy (např. HMGB-1 – high-mobility group box-1, nukleární protein vázající se na DNA), které se váží na TLR-4 (toll-like receptor) dendritických buněk. Tímto druhým signálem získává dendritická buňka pokyn kvyzrávání vantigen prezentující buňku, která vlastně započne imunitní reakci proti nádoru.

Deregulace apoptózy vede křadě patologických stavů aje průvodním znakem většiny nádorových onemocnění. Evolučně se vyvinuly dvě hlavní apoptotické dráhy, označované jako receptorová (vnější, extrinzická) amitochondriální (vnitřní, intrinzická). Obě dvě dráhy jsou spouštěny aktivací tzv. apikálních kaspáz (kaspázy jsou cysteinové proteázy, efektorové enzymy apoptózy). Vznik aktivních enzymů – kaspáz nastává štěpením neaktivních zymogenů – prokaspáz. Obě dvě apoptotické dráhy konvergují do společné apoptotické dráhy, která začíná aktivací tzv. efektorových kaspáz. Následně dochází kireverzibilním strukturálním změnám buněčných komponent (štěpení aktinu, DNA apod.) akřízené přeměně buňky vtzv. apoptotická tělíska.

1.7.1Receptorová apoptóza

Receptorová (extrinzická) apoptóza je spouštěna agregací tzv. smrtících receptorů (death receptors) – FAS/CD95, TNFR1/TNFRSF1A (tumor necrosis factor receptor/tumor necrosis factor receptor super family), TNFR2/TNFRSF1B, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5 aj.) vnávaznosti na vazbu tzv. smrtících ligandů (death ligands) – FAS ligand, TNF, TNFSF10/TRAIL (tumor necrosis factor super family/TNF-related apoptosis-inducing ligand) (obr.8A). Agregace smrtících receptorů vede kjejich internalizaci avzniku multiproteinového efektorového komplexu zvaného DISC (death inducing signaling complex). VDISC dochází kautoaktivaci apikálních kaspáz (CASP8, CASP10), které následně štěpí efektorové kaspázy (CASP3, CASP7).

Receptorová apoptóza hraje klíčovou fyziologickou úlohu například při vývoji lymfatické tkáně: až 95% thymocytů hyne vprůběhu negativní selekce či absence pozitivní selekce vthymu indukcí smrtícího receptoru uFAS smrtícím ligandem FASL. Dále má receptorová apoptóza významnou fyziologickou regulační úlohu při klonální selekci naivního lymfocytu po setkání se specifickým antigenem vzárodečném centru lymfatické uzliny, neboť eliminuje lymfocyty snáhodně vznikajícími nefunkčními receptory. Defekty vreceptorové apoptóze jsou asociovány smnoha typy malignit. Mutace ve smrtícím receptoru FAS vedou ke vzniku autoimunitního lymfoproliferačního syndromu (ALPS) abyly popsány upacientů slymfomy (např. uvelkobuněčného lymfomu zB-buněk– DLBCL).

1.7.2Mitochondriální apoptóza

Obr.8 Schéma apoptózy:

A– receptorová/extrinzická apoptóza

B – mitochondriální/intrinzická apoptóza

1.7.3Další buněčné apoptotické dráhy

Kromě receptorové amitochondriální apoptózy byly vposledních letech popsány další významné buněčné apoptotické dráhy.

1.7.4Regulátory apoptózy

Tab.2 Přehled BCL2 proteinů

Oficiální název

BAX

BCL2L4

BAD

1.8Autofagie

1.8.1Regulátory autofagie

1.9Dvojí role p53 vinhibici onkogeneze

- •genotoxického stresu (poškození DNA),

- •onkogenní signalizace (aberantní mitogenní stimuly).

1.10Buněčný cyklus

1.11Konvenčníprotinádorová léčba

- −Cytostatika působí převážně na buňky proliferující (nacházející se vbuněčném cyklu), ato značně neselektivně (takže kromě buněk nádorových postihnou inormální proliferující buňky).

- −Chemosenzitivní nádorové buňky bývají náchylnější vůči obecným cytotoxickým stimulům než buňky zdravé.

- −Jedna dávka chemoterapie (léčebná kúra) zničí vždy stejnou frakci (procento) proliferujících buněk.

- −Dosažení klinické remise neznamená úplnou eliminaci nádorové populace, nýbrž pouze pokles počtu nádorových buněk pod cca 10^9 buněk, což je hranice detekovatelnosti běžnými zobrazovacími technikami (zejména CT). Tzv.molekulární remise (tj. hranice detekovatelnosti pomocí PCR) bývá spojena spoklesem počtu nádorových buněk pod cca 10–4–10–5).

1.12Cílená protinádorová léčba

1. 1.Žádná cílená látka není stoprocentně specifická pro cílovou molekulu a/nebo signální dráhu (on-target effect), ale více či méně ovlivňuje ijiné buněčné pochody (off-target effect). Stejně tak zatím nebyly odhaleny takové biomarkery, které by byly stoprocentně specifické pro nádorové buňky. Imatinib neinhibuje pouze BCR-ABL vbuňkách CML (on-target effect), ale také tyrozinové kinázy ABL, KIT aPDGFR vnenádorových buňkách pacientů schronickou myeloidní leukemií (off target effect). Podobně rituximab se neváže pouze na CD20 antigen lymfomových či leukemických buněk, ale také na CD20 zdravých B-lymfocytů. Kromě toho se rituximab svou Fc částí váže také na Fc-receptor řady buněk imunitního systému, čímž navozuje imunomodulaci.

2. 2.Druhým důvodem pro přetrvávající toxicitu cílených léčiv je fakt, že aberantní molekuly a/nebo signální dráhy typické pro dané maligní onemocnění neplní výlučně patologickou funkci unádorového onemocnění, ale zpravidla hrají ifyziologickou roli ucelé řady buněčných procesů. Proto je jejich inhibice spojena světší či menší toxicitou vůči zdravým tkáním. Například imatinib neinhibuje pouze BCR-ABL (ubuněk CML), KIT (ubuněk GIST), respektive PDGFR (ubuněk CEL), ale také ABL, KIT aPDGFR ubuněk nenádorových. Iuchimérických fúzních proteinů (např. BCR-ABL) platí, že jejich inhibitory nejsou stoprocentně specifické pro tyto aberantní proteiny, ale „zkříženě“ inhibují ijiné – fyziologické proteiny.

1.13Biomarkery

1.14Biologickáprotinádorová léčba

Literatura

Table of Contents

Předmluva

1 Úvod do problematiky nádorových onemocnění a protinádorové léčby

1.1 Nádorová tkáň a nádorové mikroprostředí

1.2 Nádorové kmenové buňky a jejich hnízdo (niche)

1.3 Nádor jako důsledek genetické a epigenetické deregulace

1.4 Nádor jako důsledek selhání imunologického dohledu

1.5 Nádor jako důsledek chronického zánětu či infekce

1.5.1 Fyziologické aspekty zánětlivé reakce

1.5.2 Zánět a nádorová onemocnění

1.6 Lymfoproliferativní choroby jako důsledek deregulace specifické imunity

1.7 Apoptóza a její regulace

1.7.1 Receptorová apoptóza

1.7.2 Mitochondriální apoptóza

1.7.3 Další buněčné apoptotické dráhy

1.7.4 Regulátory apoptózy

1.8 Autofagie

1.8.1 Regulátory autofagie

1.9 Dvojí role p53 v inhibici onkogeneze

1.10 Buněčný cyklus

1.11 Konvenční protinádorová léčba

1.12 Cílená protinádorová léčba

1.13 Biomarkery

1.14 Biologická protinádorová léčba

Literatura