Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy
Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

Prof. MUDr. Jiří Schindler, DrSc.

MIKROBIOLOGIE
Pro studenty zdravotnických oborů
2., doplněné a přepracované vydání

TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE:

© Grada Publishing, a.s., 2014
Zdroje obrázků uvedeny v kapitole Poděkování
Technická kvalita některých obrázků je snížena vzhledem k množství a různé kvalitě zdrojů.
Cover Photo © fotobanka allphoto, 2014

Vydala GRADA Publishing, a.s.
U Průhonu 22, Praha 7
jako svou 5548. publikaci

Odpovědná redaktorka Mgr. Ivana Podmolíková
Sazba a zlom Karel Mikula
Počet stran 224 + 24 stran barevné přílohy
2. vydání, Praha 2014

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s.

Názvy produktů, firem apod. použité v této knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění však pro autory ani pro nakladatelství nevyplývají žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-247-4771-2

ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE:

ISBN 978-80-247-9275-0 (pro formát PDF)
ISBN 978-80-247-9276-7 (pro formát EPUB)

Úvod

Lékařská mikrobiologie je mikrobiologie člověka pojednávající o původcích onemocnění i o nepatogenních mikrobech v těle a v jeho bezprostředním okolí.

Tato stručná učebnice lékařské mikrobiologie je zaměřena na studenty zdravotnických oborů, především na studentky a studenty bakalářského oboru všeobecná sestra.

Výběr, rozsah a hloubka látky vycházely ze zkušenosti s výukou na tomto stupni a z realisticky pochopených potřeb v praxi. Hlavní snahou je, aby studenti poznali obecné souvislosti existence mikrobů a jejich vztahu k člověku. Cílem není memorování látky, ale její pochopení. Znalosti lékařské mikrobiologie jsou pro zvolený obor studia nástrojem a prostředkem orientace, jejich samostatné používání je však určeno lékařům.

Všichni studenti přicházející do prvního studijního kontaktu s lékařskou mikrobiologií si stěžují na obtížnost systematiky a množství jmen mikrobů, jež mají znát. Jejich stesky lze samozřejmě chápat. Z množství mikrobů byly proto v kapitolách speciální mikrobiologie, virologie, mykologie a parazitologie vybrány druhy, s nimiž se v povolání častěji setkají, nebo které znamenají ohrožení života pacienta. To je však vše, čím lze studium lékařské mikrobiologie ulehčit. Některé druhy mikrobů jsou probírány kvůli hrozbě bioterorizmu, jiné pro možnost epidemického šíření. Jména některých druhů mikrobů jsou uváděna pro seznámení a jako připomínka při případném výskytu v praxi. Každopádně je hlavním cílem studia vědět „Jak?“ a „Proč?“.

Problém výuky virologie u studentů zdravotnických oborů spočívá kromě jiného v tom, že viry pouhým okem nebo jednoduchým mikroskopem „nejsou vidět“. Druhy probíraných virů jsou vybrány podle závažnosti onemocnění, podle praktické potřeby studentů, zejména všeobecných sester, a podle epidemiologické naléhavosti.

Objem informací o virech může pro studenty zdravotnických oborů působit někde nepřiměřeně, je však potřebné poukázat na rozmanitost a komplikovanost ustrojení virů, a zdůraznit tak biomedicínský význam virových infekcí. Je na učiteli, aby své požadavky přizpůsobil svému pedagogickému záměru.

Vydavatelé se snažili umožnit prezentaci co nejvíce obrazového materiálu z archivu autora, případně elektronoptických snímků autorů z významných světových pracovišť. Z technických a ekonomických důvodů však všechny kapitoly nemohly být názorně doplněny dostatečným počtem obrázků, a proto i počet barevných verzí obrázků byl omezen. Je opět na pedagogovi, který je hlavním mediátorem výuky, aby v přednáškách a praktických cvičeních potřebné doplnil.

1Lékařská mikrobiologie

Mikroorganizmy, které žijí v lidském těle, nejsou výhradně škodlivé. Člověk je s některými (převážně bakteriemi) ve vzájemném pozitivním vztahu. Člověk – hostitel – zajišťuje prostředí, z něhož bakterie těží živiny, a jejich metabolity jsou mu prospěšné. Příkladem je Escherichia coli v tlustém střevě, která obstarává menachinon – vitamin K, jenž je zpracováván v játrech při syntéze protrombinu, který má význam pro srážlivost krve. Určité druhy bakterií, virů, hub i prvoků jsou přítomny na sliznicích a na kůži, aniž by vyvolávaly onemocnění. Jsou to organizmy nepatogenní. Vztah člověka jako hostitele a mikrobů je vztahem dynamickým, při němž se mění kvalita i kvantita mikrobů a současně s nimi i reakce organizmu hostitele.

Lékařská mikrobiologie se zabývá jak mikroby, které jsou vysloveně patogenní, tak i takovými, které vyvolávají onemocnění jen za určitých podmínek, nejčastěji při snížení imunity hostitele. Zabývá se i mikroby v bezprostředním okolí člověka, které se na člověka přenášejí, a mikroby, které se na člověka přenášejí ze zvířat. Prvotními a nejdůležitějšími objekty jsou však mikroby patogenní.

Čtyři skupiny mikrobů se vztahem k člověku jsou od sebe více či méně biologicky vzdáleny. Jejich spektrum jde od nebuněčných virů, přes jednobuněčné bakterie schopné již samostatné existence, houby – složitější organizmy s bohatou morfologií s organelami – až po parazitické jednobuněčné prvoky již podobné buňkám vyšších živočichů.

Kromě popisu vlastností těchto mikroorganizmů se lékařská mikrobiologie zabývá způsobem zneškodňování původců onemocnění fyzikálními i chemickými vlivy, zejména antimikrobními látkami – antibiotiky a antivirovými látkami. Lékařská mikrobiologie se také zabývá teorií očkovacích látek a jejich přípravy.

Klinická mikrobiologie se zabývá infekčními onemocněními a podmínkami výskytu nemocničních infekcí u pacientů oslabených základním onemocněním a zároveň vystavených infekci z prostředí. Do tohoto oboru patří i epidemiologie používaná jako nástroj zkoumání šíření infekčních onemocnění v nemocnicích i v komunitě mimo ně. V neposlední řadě k lékařské mikrobiologii patří i zájem o nová a znovu se vyskytující infekční onemocnění.

Nejjednodušší organizmy schopné reprodukce jsou viry. Jsou živé v tom smyslu, že se replikují, nejsou však schopny samostatné existence (života), protože jsou závislé na hostitelské buňce. Jsou nejmenšími infekčními agens s jedním druhem nukleové kyseliny. K replikaci používají v různé míře aparát hostitelské buňky, kterou pak většinou ničí. Jsou tedy parazity na molekulární úrovni, protože využívají makromolekuly, zejména enzymy, pro svou reprodukci. Míra tohoto využívání, tedy míra relativní autonomie, je různá. Jejich původ je předmětem teorií. Podle regresivní teorie viry vznikly únikem z hostitelské buňky. Podle teorie progresivní je základem plazmid nebo transpozon, jehož DNA byla obalena bílkovinou a získala schopnost vniknutí do buňky. RNA viry mají původ v mRNA buňky. Byly by tedy vývojově mladší než bakterie. Koevoluční teorie praví, že se viry jako biologické struktury vyvíjely nezávisle a jsou na počátku vývojové řady organizmů schopných množení. O žádné z těchto teorií nejsou důkazy a vývoj virů je zřejmě provždy tajemstvím.

Bakterie jsou nejstarší organizmy na Zemi. Existuje jich něco mezi 300 000 a jedním milionem druhů, z nichž bylo nalezeno a popsáno na tři tisíce. Bakterie jsou jednobuněčné organizmy, které si mohou obstarat energii a výživu z anorganických zdrojů. Evolucí se však tato vysoká nezávislost na prostředí změnila, některé bakterie se přizpůsobovaly prostředí, ztrácely schopnost stavby těla z anorganických zdrojů, potřebovaly doplnit výživu aminokyselinami, cukry i bílkovinami, a adaptovaly se dokonce na určitého hostitele, ačkoliv mohou růst i na relativně bohaté umělé půdě. Například Streptococcus pyogenes se vyskytuje jen u člověka. Některé bakterie ztratily schopnost růstu mimo buňku a jsou obligatorními intracelulárními parazity. Jejich strategií je množit se s co nejmenším vynaložením energie, což je vedlo k parazitizmu. Paradoxně však působí skutečnost, že činnost patogenu vede k smrti hostitele, čímž však je ohrožen sám patogen, protože logicky ztrácí možnost další existence.

Houby jsou mikroorganizmy s rozvětvenými vlákny – myceliem, která mají průchodné přepážky, jsou mnohojaderná a cytoplazma či nukleové kyseliny jimi procházejí. Nepravé houby jsou kvasinkovité organizmy, buď jednobuněčné, nebo tvoří mnohobuněčná vláknitá pseudomycelia.

Protozoa jsou jednobuněčné eukaryotické (mají jádro) organizmy s organelami. Některé mají bičíky, jiné se pohybují pomocí pseudopodií jako améby.

2Bakteriální buňka

V průběhu evoluce trvající miliony let se bakterie rozrůznily jak ve způsobu života, tak svým tvarem avelikostí. Jejich velikost je od 0,2 µ až po 0,75 mm, některé druhy rostou při 0 °C ajiné při 113 °C, při pH 0,06 apH 12, při tlaku více než 1000 atm, nebo v32% nasyceném roztoku NaCl. Vlastnosti bakterií vokolí člověka jsou dány charakterem jeho životního prostředí avlastnostmi hostitele.

2.1Morfologie

Morfologie bakterií se studuje mikroskopickými metodami. Vdiagnostice se běžně používá pozorování obarvených usmrcených bakterií, vpraxi kombinované Gramovo barvení. To kromě znázornění tvaru bakterií vypovídá ojejich charakteru – bakterie grampozitivní se od bakterií gramnegativních liší strukturou ajinými vlastnostmi, včetně mechanizmu infekce.

Velikost nejmenšího objektu, který lze spatřit (při dané vlnové délce světla) světelným mikroskopem, je dána jeho rozlišovací schopností. Je to nejmenší vzdálenost dvou bodů (objektů), které lze jako dva body rozlišit. Užitečné zvětšení mikroskopu je takové zvětšení, jež umožní pozorovat objekt nejmenší rozlišitelné velikosti. Celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu (např. 100×) aokuláru, kterým se zvětšený obraz pozoruje (např. 10×) (obr. 2.1). Konfokální mikroskop umožňuje ostře pozorovat objekt vrovině zaostření apřekrýt obraz vrovinách nad apod rovinou zaostření. Procházením rovin lze získat trojrozměrný obraz objektu. Obraz se zpracovává elektronicky pomocí vestavěného počítače. Jako zdroj světla se používá laserový paprsek, rozlišovací schopnost tohoto typu mikroskopu je proto větší než obyčejného světelného mikroskopu.

Obr. 2.1 Mikroskop starého typu dnes nepoužívaný (vlevo) asoučasný jednoduchý laboratorní mikroskop (vpravo). Hlavní části: A) objektiv (vpravo binokulární), B) sada objektivů na otočném měniči, C) kondenzor světla, D) zdroj světla (vlevo světlo zlampy odráží vzhůru zrcátko), E) zaostřovací šroub, F) stolek pro pozorovaný objekt

Elektronový mikroskop pracuje selektrony, které mají menší vlnovou délku, má větší rozlišovací schopnost aumožňuje vyšší zvětšení. Paprsek elektronů buď objektem (např. ultratenkým řezem bakterie) prochází, nebo se od objektu (celé bakterie) odráží. Transmisivní elektronová mikroskopie pracuje spaprskem elektronů podobně jako světelný mikroskop se světelným paprskem. Procházející elektrony se zachycují, obraz se zvětší afotografuje. Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky avirových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropouštějí elektrony (jedná se např. ouranyl acetát nebo molybdenan amonný). Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu) tence potažený paprskem iontů kovu, např. platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem vmístech, kam se kovové ionty nedostanou, vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz.

Tvar avelikost bakterií

Velikost bakterií významných pro medicínu se pohybuje vřádu tisícin milimetru (μ). Stafylokoky astreptokoky jsou kulovité bakterie oprůměru přibližně 1 μ. Kulovité bakterie jsou koky, tyčky různé délky buď pravidelného, nebo nepravidelného tvaru. Tyčky mohou mít tvar kyjovitý srozšířením na jednom pólu (korynebakteria), rohlíčkovitý (vibrio), obloučkovitě nebo esovitě zprohýbaný (kampylobakter), spirálový či spíše vývrtkový (treponema), některé snepravidelným stoupáním závitu (borrelie) (obr. 2.2). Některé tyčky se za podmínek prostředí prodlužují do vláken (např. Escherichia coli vmoči, legionely). Bakterie mohou být vyduté sporou uvnitř cytoplazmy, uprostřed (centrálně), nebo na konci těla (subterminálně, terminálně). Aerobní sporulující bakterie jsou bacily, anaerobní klostridia (vypadají jako vřeteno – closter).

Obr. 2.2 Základní morfologické tvary bakterií

2.2Cytologie

Navenek je bakterie ohraničena cytoplazmatickou membránou, tuhou apevnou buněčnou stěnou, ugrampozitivních bakterií silnější, ugramnegativních tenčí, které ještě mají na sobě složitou vnější membránu. Sokolním prostředím se bakterie stýkají strukturami důležitými pro přilnutí buňky hostitele, pro pohyb, pro přenos genetické informace na jiné bakterie ijako čidla stavu vnějšího prostředí.

Bakteriální chromozom je tvořen jedinou molekulou dvouvláknové DNA, která je do sebe uzavřena. Vzhledem kdélce buňky je velmi dlouhá, uE. coli měří 1 mm (obr. P1). Dvoušroubovice DNA je dalším stočením zavinuta do nepravidelné struktury apak svinuta do klubka. Aby klubko drželo pohromadě, je zpevňováno třemi bílkovinami. (Tento útvar se nazývá nukleoid, protože neobsahuje jen DNA, ale vmalém množství iRNA apodobně jako jádro eukaryot ibílkovinu [přípona -oid naznačuje, že jde opodobnost jádru]) Chromozom nese geny ajejich soubor se označuje jako genom. Nejmenší bakteriální chromozom se skládá z600 kilobází (kB), největší má 10 000 kB. Chromozom E. coli má asi 4500 kB aobsahuje na 4405 genů. Chromozom E. coli je dlouhý asi 1400 µ apři šetrném lyzování buňky je dobře patrna rozvinutá struktura. DNA určuje přímo transkripci – přepis či okopírování určitého úseku DNA na mRNA. Na ribozomech probíhá podle kódu na mRNA translace, což je řetězení aminokyselin do peptidového (bílkovinného) řetězce. Aminokyseliny přivádí na ribozom, kde je již navázána mRNA, přenosová či transferová molekula ribonukleové kyseliny – tRNA. Každá tRNA je pro danou aminokyselinu specifická apřináší jenom ji. Výběr se řídí podle kódu, který na aktuálním úseku mRNA přečte. Tak geny řídí syntézu bílkoviny, kterou určují.

Cytoplazma nemá endoplazmatické retikulum. Obsahuje ribozomy, jež jsou nástrojem proteosyntézy (obr. 2.3). Skládají se ze dvou podjednotek, jsou asi 10–20 nm velké, vbuňce jich je několik tisíc. Při sestavování molekul bílkovin jsou jakoby navlečeny na mRNA, jež obsahuje informaci, kterou aminokyselinu má právě tRNA napojit na polypeptidový řetěz. Některé druhy bakterií mají vcytoplazmě inkluze, znichž jsou nejvýznamnější volutinová granula charakterizující Corynebacterium diphtheriae. Slouží jako zásoba energie.

Obr. 2.3 Ribozom prokaryotických buněk složený ze dvou částí značených podle hmotnosti 50 Sa 30 S(CDC ATB)

Cytoplazmu ohraničuje dvouvrstvá fosfolipidová cytoplazmatická membrána. Má jemnou strukturu, její povrch se elekronopticky ozřejmí speciální technikou odlomení. Obsahuje enzymy permeázy, které selektivně transportují látky, tj. živiny dovnitř, katabolity ven zbuňky. Jsou na ní též enzymy, které syntetizují buněčnou stěnu.

Cytoplazmatická membrána naléhá na tuhou buněčnou stěnu, která určuje tvar bakteriální buňky achrání ji mechanicky zvnějšku. Zevnitř odolává osmotickému tlaku (obr. 2.4). Když se buňka zbaví stěny, praskne. Pokud na buňku grampozitivní bakterie působí enzymem lysozymem, musí se vyrovnat vnější osmotický tlak sacharózou az buňky se stane kulovitý protoplast. Buněčná stěna je pevná, silná kolem 20 nm, propouští molekuly menší než 1 nm. Je složena zřetězových makromolekul peptidoglykanu (murein nebo glykopeptid) síťovitě pospojovaných oligopeptidy. Tato struktura způsobuje její pevnost, tuhost aurčitou omezenou elasticitu. Je silnější ugrampozitivů, které obsahují ještě významnou kyselinu teichoovou. Buněčnou stěnu syntetizují enzymy transpeptidázy, které mohou také na sebe vázat penicilin (PBP – penicillin binding proteins) atím být inaktivovány. Gramnegativní buňky mají ještě vnější membránu. Je hlavní permeabilní bariérou. Její strukturu lze znáhledu vidět elektronovým mikroskopem. Propouští pasivně vodu aselektivně některé látky smalou molekulou. Vmembráně jsou bílkoviny – poriny, jež propouštějí látky smalou molekulou. Dvě molekuly porinů ksobě přiléhají, mezi nimi je pór, otvor, kterým molekuly procházejí do periplazmového prostoru apoté cytoplazmatickou membránou do nitra buňky (obr. 2.5).

Obr. 2.5 Stavební součásti buněčné stěny avnější membrány (CDC ATB)

Obr. 2.4 Ohraničení bakteriální buňky proti prostředí (CDC ATB)

Vnější membrána chrání peptidoglykan před účinkem lysozymu aje na ní vázán lipopolysacharid svýrazným biologickým účinkem. Mezi ní abuněčnou stěnou je periplazmový prostor, vněmž jsou enzymy, které mají rozličnou funkci: transport, štěpení apohyb. Jsou tu iβ-laktamázy, enzymy inaktivující penicilin ajemu příbuzné β-laktamy. Grampozitivní bakterie tento prostor nemají aenzymy vylučují do prostředí, kde štěpí makromolekulární látky, např. bílkoviny. Štěpy omenší molekule se pak snadněji dostanou do buňky.

Na povrchu některých bakterií je dobře patrné pouzdro až 1 µ silné, které do určité míry chrání buňku před nepříznivými vlivy prostředí azabraňuje fagocytóze – pohlcení leukocyty. Je většinou polysacharidové povahy (Streptococcus pneumoniae), někdy polypeptidové (Bacillus anthracis) či velmi tenké zkyseliny hyaluronové (Streptococcus pyogenes). Pouzdro, např. upneumokoků, má specifickou antigenicitu, takže protilátky proti pneumokoku jednoho antigenního typu nechrání před infekcí jinými typy. Očkovací látka proti pneumokokovým infekcím proto musí obsahovat směs antigenních typů nejčastěji vyvolávajících infekce. Pneumokokové kmeny se typizují pomocí antisér proti jednotlivým typům. Specifické antisérum způsobí zbobtnání pouzdra, jež se pozoruje vmikroskopu. Polymerní hmota na povrchu bakterie je glykokalyx, produkovaná za určitých podmínek. Může to být pouzdro nebo neorganizovaná hlenová vrstva. Je nástrojem tvorby biofilmu, protože zajišťuje přilnutí na pevný povrch – na sliznici, zubní sklovinu, implantát. Oba pojmy, pouzdro aglykokalyx, se proto významově oddělují.

Bičíky jsou silné kolem 20 nm, tedy asi padesátkrát tenčí než šířka bakterie. Jsou křehké asnadno se odlamují (obr. 2.6). Běžným barvením nejsou vidět. Voptickém mikroskopu je lze spatřit až po speciálním barvení, např. po impregnaci stříbrem. Bičík může být na pólu buňky jen jeden, nebo jich je více uspořádaných jako koňský ohon. Bičíky mohou pokrývat celé tělo bakterie (u salmonel, Escherichia coli nebo některých bacilů).

Obr. 2.6 Dlouhé bičíky E. coli neporušené preparací

Elektronová mikroskopie umožnila poznat strukturu bičíku amechaniku pohonu buňky. Bičík je složen zbílkovinných stavebních jednotek šroubovitě na sebe naskládaných. Vlákno bičíku se nehýbe jako bič, ale pohybuje se šroubovitou rotací po celé délce, je poháněno složitou bílkovinnou turbínou, již do pohybu uvádí proud protonů. Vnější vláknitá část bičíku je vsazena do duté ohnuté spojky, která může převádět rotační pohyb ve své ose. Spojka sedí na vnější membráně buňky aspojuje vlákno bičíku smotorem, který bičíkem pohybuje (obr. P2). Motor je složen ze šesti částí. Je pevně usazen vperiplazmovém prostoru. Funguje podobně jako elektromotor, ale rotor roztáčí proud protonů nebo iontů sodíku procházejících do buňky. Točivý moment se přenáší na hřídel apřes ohebnou spojku na vlastní bičík.

Bičíky E. coli rotují ve svazku rychlostí asi 18 000 otáček za minutu aposunují bakterií o30 µ za vteřinu. Urazí tak desetinásobek své délky stejně jako automobil jedoucí rychlostí 100 km/hod. Bičíky se točí doleva achvílemi se směr rotace obrátí. Pohyb chemotaxí směřuje ke zdroji živin nebo od toxických látek. Bakterie, které nemají bičíky, se mohou pohybovat jinými způsoby, např. klouzáním atrhavými pohyby těla.

Povrch buněk některých bakterií je pokryt kartáčkovitými výběžky – fimbriemi, jež vypadají jako chloupky, aproto se označují termínem pili (obr. 2.7). Jsou také složeny zbílkovin ve šroubovicovém uspořádání. Mají několikerou funkci: adherují na povrch sliznice, zakládají biofilm ina pevné neživé podložce. Fimbrií je několik typů. Fimbrie typu 1 na povrchu enterobakterií se vážou na glykoproteinové receptory buněk sliznice. Fimbrie typu 4 adherují ina bakterie, jsou relativně dlouhé, mohou smrštit apřitáhnout si buňku, na kterou se navázaly. Jsou to fimbrie sex-specifické, přítomné jen na samčích buňkách enterobakterií, ajsou nástrojem konjugace apřenosu DNA na jinou buňku.

Obr. 2.7 Elektronoptický snímek E. coli s dlouhými bičíky akrátkými fimbriemi, získaný speciální řádkovací technikou

Spory jsou klidové formy, které tvoří některé vegetativní bakterie při nepříznivých podmínkách, jako je vysušení, hladovění, vysoká teplota. Sporami si buňka zachovává život ipři těchto podmínkách, ačkoliv má všechny životní funkce zastavené (obr. 2.8, 2.9). Spory jsou rezistentní kvysoké teplotě (100 °C), organickým rozpouštědlům adezinfekčním látkám, iradiaci, kyselinám. Ačkoliv mají zastavený metabolizmus, reagují na restituci podmínek, které umožňují život původní vegetativní buňce, aklíčí – germinují. Mají složitou strukturu, uvnitř je dřeň obklopená vnitřní membránou, kůrou, obalem avnějším exosporiem. Spory tvoří aerobní grampozitivní bakterie rodu Bacillus (Bacillus anthracis) aanaerobní rodu Clostridium (Clostridium tetani). Tělo buňky se většinou sporami vydouvá. Ničí se autoklavací – vystavení teplotě 120 °C po dobu 20 minut.

Obr. 2.8 Umístění spor uvnitř tyčinkovitých buněk Bacillus cereus

Obr. 2.9 Spory uvnitř buňky. Elektronoptický snímek řezu buňkami Bacillus anthracis

2.3Růst amnožení bakterií

Růst jedné individuální bakteriální buňky, to znamená zvětšování jejího objemu, syntézu makromolekul avedlejších metabolitů až do momentu, kdy je růst dokončen, nelze sledovat (a pro praxi nemá velký význam). Před ukončením růstu se bakterie rozdělí, obě buňky, teoreticky rovnocenné, pokračují vrůstu acyklus se opakuje.

2.3.1Růst vtekuté půdě

Velikost populace bakterií živých imrtvých lze sledovat:

■přímo počítáním buněk vurčitém (malém) objemu mikroskopem,

■měřením zákalu, který např. vjednotkovém objemu kultivační půdy způsobí nejméně statisíce buněk,

■vážením sušiny buněk odebraných zkultivační půdy.

(U obou posledních metod je ovšem nutné zákal, respektive hmotnost bakterií kalibrovat na počet buněk.)

Odběry aměření se mohou dít opakovaně ve zvolených časových intervalech apodle toho lze poznat průběh růstu populace bakterií, která se za laboratorních podmínek pěstování označuje jako kultura bakterií.

Předpokládejme, že se jedna bakterie dostane do tekutého živného prostředí. To lze provést experimentálně vlaboratoři za optimálních podmínek. Tato jedna bakterie se za určitý čas rozdělí na dvě. Ony dvě buňky se rozdělí av médiu jsou již čtyři, ze čtyř je pak osm atd. Evidentně lze předvídat, kolik by na konec teoreticky mohlo být vdané půdě bakterií, neboť konečný počet buněk B by byl 1 × 2n. Tedy:

B = B0 × 2n,

kdy B0 je počet bakterií na počátku an počet generací.

Generací se rozumí zdvojení počtu buněk. Buňky se rozdělují vurčitém čase, což je tzv. generační doba. Čím je generační doba kratší, tím roste populace rychleji. Platí, že za optimálních podmínek je generační doba E. coli 20 minut, generační doba Mycobacterium tuberculosis je při kultivaci vlaboratoři 36 hodin. Rychlost množení c je dána počtem generací za jednotku časovou t, např. za hodinu:

c = n/t

Zaznamenáváme-li počet buněk po naočkování do tekuté půdy včase, získáme typickou růstovou křivku, zníž jsou zřejmé fáze množení. Po naočkování se buňky adaptují na nové podmínky ametabolizmus se zklidové fáze přepíná na aktivní. Tato fáze, kdy buněk nepřibývá, je lag fáze. Pomalu anesynchronně se buňky začínají dělit, křivka se ohýbá apřechází do fáze vyrovnaného růstu skonstantní maximální rychlostí množení, kdy se všechny buňky dělí stejným tempem abílkoviny inukleové kyseliny se syntetizují stejnou rychlostí. Počet buněk roste exponenciálně, proto se tento interval označuje jako exponenciální fáze (obr. 2.10). Lineární průběh je zřejmý po vynesení logaritmu počtu buněk včase (odtud někdy používané označení logaritmická fáze). Rychlost množení se pozvolna snižuje apo fázi zpomalení se populace dostává do stacionární fáze, kdy buněk nepřibývá, ani neubývá. Po další době začne živých buněk ubývat apopulace je ve fázi hynutí. Proč kultura přechází do stacionární fáze, když prokazatelně nejsou vyčerpány živiny, není zcela vysvětleno (jistě mohou být vyčerpány limitní živiny anahromaďují se toxické metabolity).

Obr. 2.10 Základní fáze růstové křivky bakterií

V optimální tekuté půdě (živném bujonu) se za 18 hodin namnoží modelová bakterie E. coli při teplotě 35 °C do koncentrace 109 buněk/ml. Při pohledu je původně čirá kultivační půda ve zkumavce mléčně zakalená, je slabě průsvitná aneprůhledná. Takto rostou nepříliš náročné střevní bakterie, pseudomonády, stafylokoky.

2.3.2Růst na pevné půdě

Bakterie se pěstují na živných půdách vkulatých skleněných nebo plastových miskách. Rostou vkupkách, kterým se výstižně říká kolonie, neboť osídlují určité území.

Zpočátku se bakterie pěstovaly vpřirozených tekutých půdách iv těch umělých, jako je masový bujon, ovšem nebylo možno od sebe oddělit bakterie různých druhů. To umožnily až agarové půdy. Jednotlivé druhy bakterií rostou voddělených koloniích, alze je tak získat včisté kultuře.

Kolonie bakterií mají rozmanitou velikost, tvar, konzistenci, zbarvení, mají lesklý nebo hrubý povrch, různě se ohraničují od podložky, na níž rostou. Kolonie některých bakterií jsou typicky zbarveny pigmentem, ujiných barvivo difunduje také do půdy azabarvuje ji, některé fluoreskují nebo svítí (obr. P3, P4).

Bakterie zdomény lékařské mikrobiologie vyrůstají převážnou většinou za 18 až 48 hodin vkoloniích. Mladé kolonie jsou konvexní útvary, hladkého či drsného povrchu, většinou pravidelného tvaru. Kolonie aktinomycet, klostridií abacilů tvoří bizarní rozvětvené útvary složené ze sektorů nepravidelné struktury slaločnatými okraji (obr. 2.11). Tak dorůstají ikolonie, které za 24 hodin byly zcela pravidelné.

Obr. 2.11 Stromovitá struktura vyvinuté kolonie Bacillus pumilus po 7 dnech

Kolonie modelové bakterie Escherichia coli jsou po 24 hodinách za optimálních laboratorních podmínek pravidelné, okraj je tvořen různě dlouhými buňkami, často vtenkých provazcích (obr. P5). Po několikadenní kultivaci, také vlivem lokálního vyčerpání živin, mají ikolonie Escherichia coli aostatních gramnegativních tyček rozsochatou strukturu, jako je pravidlem ubacilů. Pravidelný okrouhlý tvar kolonie je více méně artefaktem krátké kultivace vnadbytku živin, který se bakteriím nabízí vlaboratoři (obr. 2.12, P6).

Obr. 2.12 Kolonie Streptococcus mitis, která má na okraji dceřiné kolonie, znichž se pak šíří do okolí opět pomocí dceřiných kolonií. Tento způsob není běžný

Růst kolonie

Množením buněk se populace prostorově zhušťuje abuňky na okraji se vytlačují do volné plochy. Pohyblivé bakterie putují po agarové půdě zperiferie aplazivým růstem se šíří koncentricky ve vlnách. Například bakterie rodu Proteus přerůstají všechny bakterie izolované ze vzorku od pacienta, aproto je nutno jeho šíření po agaru zabránit. Dociluje se toho jednoduše použitím kultivační půdy svyšším obsahem agaru. Taková půda je tužší aostatní bakterie lze pak dobře izolovat.

2.4Biofilm

Biofilm je společenství mikrobiálních buněk nevratně přichycených kpodložce nebo kokolním buňkám, usazeným vpolymerní mimobuněčné hmotě, kterou samy produkují, jež mají změněný fenotyp (růstové vlastnosti). Biofilmem není povlak bakterií nebo plochá kolonie, pokud nemají tyto bakterie změněný fenotyp.

2.4.1Vznik asložení biofilmu

Volně plovoucí planktonické buňky se přichycují na pevný povrch pomocí adhezinů. Po přichycení změní své chování afenotyp. Produkují velké množství lepivého polysacharidu podobného škrobu (obr. P7). Vytváří se zněj hlenová matrice, která drží buňky pohromadě afunguje jako voštinové lešení (obr. 2.13), vněmž se buňky množí, tvoří se mikrokolonie aspleť kanálků (obr. 2.14, 2.15). Zbiofilmu se ale na určitý impulz také buňky odlučují, přecházejí do planktonického stavu, odplouvají akolonizují další části povrchu.

Obr. 2.13 Systém kanálků vbiofilmu

Obr. 2.14 Mikroskopický řez biofilmem. Kanálkem vhmotě biofilmu proudí tekutina srozpuštěnými živinami

Obr. 2.15 Voštinová struktura polymerní matrice biofilmu nesoucí uvnitř stafylokoky. Tenká vlákna polysacharidu glykokalyxu lepí buňky ksobě navzájem ake stěnám voštinového lešení

Biofilm lze zobrazovat konfokálním laserovým mikroskopem voptických řezech az nich složit prostorovou strukturu. Lze pořídit ianimovaný záznam dějů vbiofilmu.

Podle dostupnosti živin kolísá tloušťka biofilmu od několika µ do stovky µ. Biofilm není homogenní, skládá se ze shluků buněk ačetných dutin propojených kanálky. Bakterie vněm rostou vmikrokoloniích. Polymerní matrice vytváří voštinovou strukturu, vníž jsou buňky přichyceny. Zhruba šestistěnné komůrky voštiny mají stěnu tlustou 150 nm.

2.4.2Biofilm amedicína

Tvorba biofilmu azejména změna vlastností buněk má pro patogenezi některých infekčních onemocnění rozhodující význam. Nejdéle známý biofilm vlidském těle je povlak na zubní sklovině – zubní plak. Je fyziologický, vzniká přirozeně. Lze ho sice odstranit, ale vždy se tvoří znovu. Biofilmem kolonizují sliznice nepatogenní ipatogenní bakterie.

Biofilm hraje významnou roli vinfekcích, kdy se patogenní bakterie usadí na sliznici nebo uvnitř tkáně. Typickým případem je bakteriální endokarditida, srdeční zánět. Na chlopních se vytváří biofilm aza účasti fibrinu vzniknou vegetace. Endokarditida je způsobena převážně koky – streptokoky různého druhu, nebo stafylokoky. Toto onemocnění se velmi těžko léčí. Respirační choroba cystická fibróza je genetické onemocnění, při němž jsou pozměněny poměry vdolních cestách dýchacích. Kprimárním respiračním infekcím se přidávají chronické nebo opakující se infekce. Mají za následek ucpávání průdušek atrvalé poškození jejich epitelu. Na poškozeném terénu se později biofilmem usadí Pseudomonas aeruginosa ajemu podobné druhy. Biofilm se vyskytuje ipři chronickém zánětu prostaty. Bakterie pronikají do prostaty proti proudu moči, zakutní prostatitidy se vyvine chronická, kterou biofilm zprvu jen komplikuje, později je ijejí příčinou.

Častá jsou infekční onemocnění vdutině ústní. Při periodontitidě vzniká vkapsách pod dásní polymikrobní biofilm, do něhož neproniká kyslík. Nahromaděná bakteriální hmota, odumřelé buňky tkáně ahnisavé buňky situaci zhoršují, neboť redukující prostředí napomáhá pomnožení anaerobních bakterií. Biofilm se vytváří také na špatně vyživované kůži apodkoží při bércových vředech aúčastní se tak bludného kruhu – chabého krevního zásobení, nekrózy apůsobení bakterií. Biofilm se vytváří ina povrchu popálených ploch. Systematické chirurgické ošetřování eliminuje nebezpečí ztvorby biofilmu aohrožení života jen kvůli infekci popálenin je minimalizováno.

Cizí tělesa – cévky, náhrady

Obr. 2.16 Adherující stafylokoky vytvářejí na povrchu katétru bohatou slizovou hmotu

Obr. 2.17 Stafylokoky adherují navzájem na povrch katétru

2.4.3Rezistence buněk biofilmu kantibiotikům

Hlenovou hmotou jsou buňky vbiofilmu také fyzicky chráněny před protilátkami.

2.5Genetika bakterií

Přenos genů

Sexuální polarita

2.6Nástroje patogenity apatogeneze bakteriálních infekcí

2.6.1Adherence, kolonizace

Tab. 2.1 Nejvýznamnější adheziny

Mikrob

Epitel

2.6.2Tvorba toxinů, toxiny

2.6.3Patogenní ostrovy vgenomu

2.6.4Perzistoři

2.7Usmrcení bakterií

2.7.1Fyzikální vlivy

2.7.2Chemické vlivy

2.8Klasifikace bakterií