Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy

Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována ani šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno.

doc. MUDr. Petr Dulíček, Ph.D.

Poruchy hemostázy v klinické praxi

Autor:

doc. MUDr. Petr Dulíček, Ph.D.

IV. interní hematologická klinika Lékařské fakulty v Hradci Králové Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice Hradec Králové

Recenzenti:

MUDr. Alena Buliková, Ph.D.

Interní hematologická a onkologická klinika Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno

Oddělení klinické hematologie Fakultní nemocnice Brno

MUDr. Jaromír Gumulec, Ph.D.

Klinika hematoonkologie Fakultní nemocnice Ostrava a Lékařské fakulty Ostravské univerzity

Obrázky dodal autor. Obrázky 1.4, 1.18, 2.5, 2.8, 2.12, 2.15, 2.17, 2.25, 2.26, 3.2, 3.4, 3.26, 4.1 překreslil Jiří Hlaváček.

Obrázky 1.1, 1.2, 1.3, 2.6, 2.13 a 2.30 pocházejí z depositphotos.com.

Práce byla podpořena programem Cooperatio, vědní oblast ONCO.

Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s.

Cover Photo © depositphotos.com, 2022

Cover Design © Grada Publishing, a.s., 2022

© Grada Publishing, a.s., 2022

Vydala Grada Publishing, a.s.

U Průhonu 22, Praha 7

jako svou 8554. publikaci

Šéfredaktorka lékařské literatury MUDr. Michaela Lízlerová

Odpovědný redaktor Mgr. Michal Zlatoš

Sazba a zlom Radek Hrdlička

Formát ePub Štěpán Böhm

Počet stran 262

1. vydání, Praha 2022

Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod a.s.

Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno.

Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění však pro autory ani pro nakladatelství nevyplývají žádné právní důsledky.

ISBN 978-80-271-4935-3 (ePub)

ISBN 978-80-271-4934-6 (pdf)

ISBN 978-80-271-3337-6 (print)

Předmluva

Vážení kolegové, milí čtenáři,

do rukou se Vám dostává kniha, která se věnuje trombóze a hemostáze s cílem probrat tuto tematiku od teorie k praxi. Od standardní teoretické části postupně přecházíme do klinické praxe až do závěrečné části, která popisuje padesát vybraných případů z reálné praxe, tak jak je v posledních více než 20 letech přinesl život. Poměrně velká část je věnovaná antikoagulační terapii, protože jedinců s touto terapií přibývá a problematika se týká všech klinických oborů.

Koho chceme knihou oslovit? Všechny, kteří s touto tematikou přicházejí do styku, od studentů medicíny přes účastníky postgraduálního vzdělávání až po lékaře v klinické praxi.

Bude-li kniha čtenáři hodnocena jako přínosná pro studium či klinickou praxi, bude to pro nás největší odměna.

Závěrem mi dovolte poděkovat velikému množství kolegů, mým učitelům, nadřízeným, kteří mi pomáhali v rozvíjení znalostí o  hemostáze. Mé poděkování patří také kolegům doc. Malému, Ph.D., a Mgr. Iloně Fátorové za poskytnutí bohaté obrazové dokumentace.

Váš Petr Dulíček

Hradec Králové, srpen 2022

1Teoretická část

1.1Základní principy hemostázy

Hemostáza představuje jeden zmechanismů, které udržují integritu vnitřního prostředí. Za fyziologických poměrů hemostáza zajišťuje fluiditu krve vintaktním cévním řečišti avpřípadě poruchy kontinuity cévní stěny dochází kaktivaci hemostatických mechanismů akzástavě krvácení. Hemostatická rovnováha je velmi důmyslně vyvážená, na její funkci se podílí: cévní stěna, krevní destičky (trombocyty) aplazmatické faktory, které zahrnují systém koagulační, fibrinolytický ajejich inhibitory. Narušení hemostatické rovnováhy může vyústit na jedné straně vkrvácivý stav ana straně druhé ve stav trombofilní (obr. 1.1).

1.1.1Primární hemostáza

Normální funkce cévní stěny vhemostáze je komplexním výsledkem její neporušené struktury, metabolické aktivity atvorby řady hemostaticky aktivních látek. Povrch souvislé endoteliální výstelky je vpodstatě inertní ke krevním hemostatickým činitelům. Vsubendoteliu jsou přítomny tzv. adhezivní proteiny, kolagen, von Willebrandův faktor (vWF), trombospondin, fibronektin adalší. Endoteliální buňky syntetizují prostaglandin I_2, tzv. EDRF (endoteliální relaxační faktor), tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA) ajeho inhibitor (PAI-1). Součástí membrány endoteliálních buněk jsou dále glykosaminoglykany sheparinovým účinkem (heparansulfáty) atrombomodulin.

Obr. 1.1 Průřez cévou saterosklerotickými pláty (Depositphotos)

Úloha cévní stěny je tedy vpodstatě dvojí: mechanická, kdy bezprostředně po poranění dochází kreflexní nervově podmíněné krátkodobé vazokonstrikci, která je vystřídána vazokonstrikcí způsobenou látkami uvolněnými ztrombocytů (tromboxan A_2, serotonin). Za několik minut je vazokonstrikce vystřídaná vazodilatací, která usnadňuje rychlé odplavení hemostaticky aktivních látek aje důležitá pro vymezení procesu krevního srážení jen na místo poranění. Vazodilataci vyvolává oxid dusnatý (NO) aprostaglandin I_2.

Úloha krevních destiček je vhemostáze mnohostranná. Jedná se obezjaderné krevní elementy tvaru disků oprůměru 2–4 μm, objemu 4–8 fl. Vznikají vkostní dřeni fragmentací nebo odštěpováním periferní cytoplazmy megakaryocytů. Jejich morfologie je poměrně komplikovaná. Dvě třetiny celkového počtu kolují vperiferní krvi, zbývající třetina je deponována ve slezině.

Morfologie trombocytů

•Mitochondrie, Golgiho aparát, denzní tubulární systém, lyzosomy, destičková granula: alfagranula obsahují: vWF, destičkový faktor 4 (PF4), fibrinogen, trombospondin, faktorV;denzní granula obsahují: ADP (adenosindifosfát), ATP (adenosintrifosfát), Ca2+, serotonin.

•Cytoplazma – aktin, myozin (konstrikce destiček má význam pro uvolnění obsahu granul).

•Membrána je tvořena lipoproteinovou dvojvrstvou snegativně nabitými fosfolipidy na „rubové straně“. Vzevní vrstvě jsou umístěny specifické glykoproteiny (GP).

•Na povrchu destiček se nacházejí antigeny skupiny AB0, antigeny HLA I. třídy aspecifické destičkové antigeny (HPA).

•Funkce trombocytů je mnohostranná: jsou nezbytné pro normální funkci cévní stěny, mají klíčovou úlohu vprimární hemostáze auplatňují se také vprocesu plazmatické koagulace.

Úloha trombocytů vprimární hemostáze

Po poranění cévy se trombocyty aktivují kontaktem se subendoteliálními strukturami. Tato aktivace vede prostřednictvím cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP) acyklického guanosinmonofosfátu (cGMP) ke strukturním změnám membrány apřesunům intracelulárního Ca2+. Uvedené změny iniciují všechna následující stadia nezbytná kvytvoření krevní zátky, tj. adhezi, tvarové změny destičky, sekreci, agregaci aretrakci.

Stadium adheze – bezprostředně po poranění endoteliální výstelky se trombocyty hromadí vmístě poškozené cévy aadherují ksubendoteliálním strukturám. Promptní adheze je funkcí glykoproteinu Ia na povrchu trombocytu. Kjejímu pokračování je nezbytná přítomnost dalšího glykoproteinového receptoru GP Ib/IX/V(tab. 1.1) avWF. Tento faktor tvoří most mezi subendoteliálními strukturami atrombocyty.

Stadium tvarové změny – adherující destičky mění po kontaktu skolagenem svůj tvar na kulatý. Vytvářejí pseudopodie arozprostírají se po exponovaném povrchu (obr. 1.3). Současně dochází ke změnám povrchových vlastností membrány destiček aksekreci důležitých komponent.

Stadium sekrece – ztrombocytů je nejdříve secernován obsah α-granul (vWf, PF4, PDGF [platelet derived growth factor], FV, β-tromboglobulin, trombospondin aj.) apři silnějším stimulu iobsah δ-granul (tj. denzních granul, ato ADP, ATP, serotonin aCa2+).

Stadium agregace – znamená shlukování krevních destiček zkrevního proudu ktrombocytům již adherovaným. Hlavními fyziologickými induktory agregace je ADP atromboxan A_2 (TXA2), jenž vzniká biotransformací zahájenou aktivací destičkové fosfolipázy. Na agregaci se rovněž podílí trombin vzniklý vmalém množství na povrchu destiček. Agregace trombocytů je závislá na přítomnosti dvou dalších glykoproteinových receptorů (GP IIb aGp IIIa) vmembráně destiček, fibrinogenu aCa2+. Fibrinogen spojuje destičky apodmiňuje tím tvorbu agregátů. Zatímco TXA2 podporuje uvolňování ADP, prostacyklin PGI_2, který vzniká vcévních endoteliích, uvolňování ADP brzdí, inhibuje agregaci destiček azabraňuje tvorbě destičkových trombů mimo místo poranění. Vede navíc klokální vazodilataci. Adhezí aagregací krevních destiček vzniká tzv. primární hemostatická zátka (obr. 1.4).

Stadium retrakce je posledním krokem primární hemostázy. Znamená smrštění již utvořené krevní sraženiny (zátky). Jedná se odestičkovou funkci, která umožňuje, aby pseudopodia přilnula kfibrinovým vláknům. Smrštění kontraktilních bílkovin destiček („zatažení pseudopodií“) vyvolá retrakci koagula.

Úloha trombocytů vplazmatické koagulaci

Krevní destičky jednak poskytují povrch kfyziologickému průběhu koagulačních reakcí, jednak se reakcí samy účastní. Přesunem negativně nabitých fosfolipidů do zevní vrstvy membrány (tzv. flip-flop) vytvářejí vazebná místa pro vitamin K-dependentní koagulační faktory. Tato vazebná místa slouží také kselektivní vazbě F VaF VIII – tj. kofaktorů uplatňujících se při tvorbě komplexů koagulačních faktorů sdestičkovými fosfolipidy. Trombocyty aktivované prostřednictvím ADP také mohou za přítomnosti F XI přímo aktivovat F XII (obr. 1.2).

Obr. 1.2 Trombocyty vkrevním oběhu ajejich aktivace (Depositphotos)

Obr. 1.3 Trombocyty spseudopodii (Depositphotos)

Tab. 1.1 Receptory na krevních destičkách

Receptory pro adhezi destiček ke kolagenu

membránové GP;

vdůsledku konformačních změn se po navázání vWF na komplex GP Ib-IX-Vaktivuje komplex GP IIb/IIIa, který pak může vázat fibrinogen; molekuly fibrinogenu vytváří mezi destičkami můstky, které slouží jako podklad pro agregaci destiček; vpřípadě nedostatku fibrinogenu plní roli můstku vWF, který se za těchto okolností může vázat také ke komplexu GPIIb/IIIa

GPIa/IIa, GPVI, GPIV

vysoký střihový stres

GPIb-IX-V

Membránové glykoproteiny

komplex GP Ib-IX-V

nedostatečná syntéza tohoto komplexu vede ke vzniku Bernardova-Soulierova syndromu

GPIa/IIa

na povrchu destiček existuje vysoká variabilita exprese tohoto komplexu zejména vsouvislosti spolymorfismem genu pro podjednotku GPIa; často dochází kbodové záměně na pozici 807 (C–T bodové mutace), která je spojená snebezpečím infarktu myokardu či sischemickou cévní mozkovou příhodou

komplex GPIIb/IIIa na molekule fibrinogenu

defekt komplexu IIb/IIIa se projevuje jako Glanzmannova trombastenie;

pacientům zcela chybí schopnost trombocytů agregovat

GPV/IIIa (GPV/IIIa = integrin α 5β_3)

komplex se nachází především na endoteliálních buňkách, ale ina buňkách hladké svaloviny, makrofázích atrombocytech;

jeho hlavní funkce je adheze těchto buněk ke složkám extracelulární matrix

Obr. 1.4 Funkce trombocytů vhemostáze; GP Ia/IIa = glykoprotein Ia/IIa, GP IIb/IIIa = glykoprotein IIb/IIIa, GP Ib/IX/V= glykoprotein GP Ib/IX/V, vWF = von Willebrandův faktor (překreslil Jiří Hlaváček)

1.1.2Plazmatická část koagulace

Výsledkem aktivace plazmatických koagulačních faktorů je vytvoření stabilního fibrinu. Fibrin vytváří fibrinovou síť na trombocytární matrici, kterou tím zpevňuje. Vznik stabilního fibrinu je výsledkem vzájemného působení koagulačních plazmatických proteinů. Tento děj představuje reakci, při které se neaktivní protein (proenzym) mění na aktivní enzym aten aktivuje další proenzym.

Koagulační faktory

Koagulační faktory (tab. 1.2) je možné dělit podle chemické struktury apodle funkce vhemostáze. Podle chemické struktury se dělí takto:

a)Proenzymy (zymogeny, serinové proteázy), které mají po rozštěpení enzymatickou aktivitu. Do této skupiny patří: F II, F VII, F IX, F X, F XI, F XII aprekalikrein.

b)Kofaktory, které se účastní tvorby koagulačních faktorů sfosfolipidy aurychlují enzymatické reakce. Jde o:F V, F VIII, vysokomolekulární kininogen (HMWK) atkáňový faktor (TF).

c)Substráty – knim patří fibrinogen, který je základním koagulačním substrátem pro trombin.

d)Transglutamináza F XIII.

Tab. 1.2 Přehled koagulačních faktorů

Název

Dřívější označení

Zkratka

Místo syntézy

K pl

T1/2

(hod.)

MV

(kDa)

Chr

Faktor I

fibrinogen

F I

játra

2–4 g/l

72–120

340

4

Faktor II

protrombin

F II

játra

0,1–0,2 g/l

60–96

72

11

Tkáňový faktor

tromboplastin

TF

mnoho tkání

0

–

37

1

Faktor V

proakcelerin

F V

játra, megakaryocyt

8–14 mg/ml

8–24

330

1

Faktor VII

prokonvertin

F VII

játra

2–5 mg/ml

4–6

50

13

Faktor VIII

antihemofilický globulin

F VIII

játra

0,1 mg/ml

8–12

330

X

Faktor IX

antihemofilický faktor

F IX

játra

3–4 mg/ml

18–30

56

X

Faktor X

Stuartův-Prowerové faktor

F X

játra

6–8 mg/ml

30–48

56

13

Faktor XI

Rosenthalův faktor

F XI

játra

5–7 mg/ml

48–60

160

4

Faktor XII

Hagemanův faktor

F XII

játra

30–40 mg/ml

50–70

80

5

Faktor XIII

fibrin stabilizující faktor

F XIII

játra (b) mega-

karyocyt (a)

10–20 mg/ml

72–160

320

1 (b) 6 (a)

Prekalikrein

Fletcherův faktor

PK

játra

35–50 mg/ml

30–40

90

4

HMWK

Fitzgeraldův faktor

HMWK

játra?

60–80 mg/ml

120–150

120

3

Kpl = rozsah plazmatické koncentrace, MV = molekulová hmotnost, T1/2 (hod.) = biologický poločas eliminace, Chr = chromosom jako nositel příslušného genu

Pozn.: Koagulační faktory označujeme písmenem F (faktor), římskou číslicí (včasovém pořadí, vjakém byly objeveny) ajejich aktivovanou formu malým písmenem a– např. aktivovaný pátý faktor – F Va. Většina koagulačních faktorů byla izolována včisté formě, abylo proto možné stanovit jejich složení adnes ipřesné složení genu, který kóduje danou bílkovinu.

Faktor VIII tvoří komplex svon Willebrandovým faktorem. Von Willebrandův faktor pochází zmegakaryocytů aendoteliálních buněk, T1/2 = 6 hod. Vtěle zajišťuje dvojí funkci. Je důležitý proprimární hemostázu (viz výše) aslouží jako nosič pro FVIII, prodlužuje jeho T1/2.

Podle jejich rozdílné funkce vprocesu krevního srážení můžeme koagulační faktory rozdělit do pěti skupin:

•bílkoviny sloužící jako kofaktory enzymů,

•serinové proteázy – katalyzují parciální proteolýzu koagulačních faktorů,

•Ca2+ – napomáhá vazbě některých koagulačních faktorů na membránové fosfolipidy,

•fibrinogen – prekurzor fibrinové sítě,

•transglutamináza (F XIII) stabilizuje fibrinovou síť.

Vtradičním pohledu na koagulaci je koagulační kaskáda zahajována ve dvou téměř nezávislých systémech, které se podílejí na aktivaci F X (obr. 1.5). Vnější koagulační systém se spouští uvolněním TF. Ten má jako iniciátor aktivace koagulace zásadní místo. TF je lipoprotein přítomný ve většině tkání, především vmozku, placentě, plicích, ale ivendoteliálních buňkách amonocytech. Proteinovou část TF tvoří apoprotein III, který se vpoměru 1 : 450 váže sfosfatidyletanolaminem. TF postrádá enzymatickou aktivitu, působí jako kofaktor při tvorbě komplexu sF VIIa. Vnitřní koagulační systém je aktivován kontaktem se smáčivou plochou. Aktivace F X, která zahajuje tvorbu fibrinu, je společnou částí koagulační kaskády. Proces tvorby fibrinu může být zahájen tedy dvěma způsoby: zevní cestou – expozicí krve kpoškozené cévě, nebo vnitřní cestou, která je iniciována cestou F XII (Hagemanův faktor), tato cesta zahrnuje také HMWK akalikrein. Tyto tři faktory patří ke kontaktnímu systému. Kontakt snegativně nabitými povrchy vede ke konformační změně vzymogenu – F XII, což vede ktvorbě malého množství aktivní formy FXII (F XIIa). Ten vede ke změně prekalikreinu na kalikrein, který recipročně aktivuje F XII. F XIIa vede též kaktivaci F XI ataké dochází kuvolnění zánětlivého mediátoru bradykininu (BK) zHMWK díky kalikreinu. Vazba BK ke kininovému B2 receptoru (B2R) aktivuje prozánětlivou signální cestu, která vede kdilataci cév, indukci chemotaxe neutrofilů azvýšení vaskulární permeability. Tudíž kontaktní systém cestou F XIIa má prozánětlivé aprokoagulační vlastnosti cestou kalikrein-kininového systému avnitřní koagulační cestou. Serpin C1 inhibitor esterázy (C1INH) je hlavní plazmatický inhibitor F XIIa aprekalikreinu akontroluje proteolytickou aktivitu kontaktní cesty koagulace. Kromě C1INH mají schopnost blokovat FXIIa také antitrombin (AT) aPAI-1. Invitro F XIIa vede kaktivaci komplementu ainiciuje fibrinolytický systém prekalikreinem zprostředkovanou aktivaci urokinázy. Není zcela jisté, zda toto platí ipro situaci in vivo.

Obr. 1.5 Klasické dělení koagulační kaskády

Podle nynějších poznatků není oddělení obou aktivačních systémů úplné. Existuje přímá aktivace F IX ve vnitřním systému aktivovaným F VII ze zevního systému. Zajímavé je, že defekty F XII, prekalikreinu aHMWK prodlužují aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT) in vitro, ale in vivo nejsou krvácivé projevy přítomny. Podle nejnovějších poznatků se krevní srážení odehrává vetřech následujících fázích (obr. 1.6):

a)iniciace, kdy na základě podnětu dochází kuvolnění TF atím kaktivaci koagulačních faktorů,

b)amplifikace, kdy dochází vlivem F Xa ke změně protrombinu na trombin,

c)propagace, kdy aktivní proteolytický enzym trombin aktivuje další koagulační faktory avytváří aktivní povrch na destičkové membráně aštěpí fibrinogen na fibrinové monomery, které polymerizují do stabilního fibrinu.

Obr. 1.6 Fáze koagulace: iniciace, amplifikace apropagace

Klíčovým enzymem vhemostáze je trombin (F IIa). Zasahuje svysokou aktivitou do celé řady aktivačních procesů, jak je ukázáno vtabulce 1.3.

Tab. 1.3 Úloha trombinu vhemostáze

Prokoagulační účinek

štěpení fibrinogenu

aktivace F V, F VIII aF XI

aktivace F XIII

aktivace trombocytů

TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor)

Antikoagulační účinek

aktivace proteinu C

Kromě svého hlavního úkolu (štěpení fibrinogenu) aktivuje faktory F VIII, FV, F XIII azpětnou vazbou tak autokatalyzuje svou vlastní tvorbu. Dále aktivuje (zvýšením agregace) trombocyty. Trombin má kromě výše uvedených „prokoagulačních“ vlastností iúčinky antikoagulační (obr. 1.7). Po vazbě na trombomodulin na povrchu endotelu ztrácí svůj prokoagulační účinek aaktivuje protein C (trombomodulin je vtéto reakci kofaktorem), který pak proteolyticky štěpí F Va aF VIIIa. Zároveň také aktivuje inhibitor fibrinolýzy TAFI, látku dříve označovanou jako prokarboxypeptidáza B. TAFI přítomný ve fibrinu znesnadňuje přeměnu plazminogenu na plazmin asnižuje tak účinek fibrinolýzy na krevní sraženinu. TAFI je tak prostředníkem mezi koagulačními afibrinolytickými mechanismy azajišťuje funkce prokoagulační.

Obr. 1.7 Úloha trombinu vhemostáze

Přirozené inhibitory koagulace

Slouží krestrikci koagulačního procesu, lokalizaci cévního poškození achrání cévy proti trombóze. Dělíme je dle místa funkce do následujících skupin:

a)Inhibitory serinových proteáz

Do této skupiny patří antitrombin, heparinový kofaktor II (HC II), C_1 inhibitor esteráz, inhibitor aktivovaného proteinu C aněkolik dalších, méně významných inhibitorů. Za 80%inhibiční aktivity plazmy (inhibiční kapacita 1ml plazmy představuje schopnost inhibovat 750IU trombinu) jsou zodpovědné AT aHC II.

Antitrombin je protein akutní fáze, jednořetězcový α_2-glykoprotein, který je tvořen vjátrech avcévním endotelu. T1/2 představuje 45–72 hodin, aktivita se pohybuje vrozsahu 80–120%. Se serinovými proteázami tvoří stabilní komplexy vpoměru 1:1, nejvyšší aktivitu vykazuje vůči trombinu, pomaleji reaguje sFIXa, F Xa, F XIa aF XIIa. Tato reakce je až 1000× urychlena heparinem. Antitrombin neinhibuje samotný F VIIa, ale je důležitým blokátorem komplexu TF-F VIIa.

Heparinový kofaktor II blokuje především trombin. Blokáda trombinu je urychlena heparinem (za podmínky, že koncentrace heparinu je 50–100× vyšší). Blokáda je urychlována také dermatansulfátem aheparinoidy přítomnými na povrchu endoteliálních buněk. HC II neinhibuje F Xa.

C_1 inhibitor esteráz (C1INH) je aktivovaná forma komplementární komponenty. Tvoří komplex sfaktory kontaktní fáze. Alfa-2-antitrypsin blokuje zejména F Xa. Jeho hlavní účinek je namířen proti proteázám leukocytárním apankreatickým.

b)Inhibitory kofaktorů koagulačních faktorů – systém proteinu C

Trombomodulin (TM) vmembráně endotelu přímo inhibuje prokoagulační aktivitu trombinu aurychluje aktivaci dalšího inhibitoru – proteinu C trombinem. Protein C je vitamin K_1-dependentní glykoprotein, tvořený vjátrech. Jeho T1/2 je 5–7 hodin. Aktivita vplazmě se pohybuje vrozsahu 70–140%. Způsobuje proteolytickou inaktivaci F Va aF VIIIa. Vtéto reakci je kofaktorem protein S, jenž tak působí ipři inaktivaci F VIIIa iF V.

c)Inhibitor zevního systému aktivace hemostázy (TFPI)

TFPI (tissue factor pathway inhibitor) patří mezi kininy, které mají charakteristickou část molekuly, jež se nazývá Kunitzova doména. Jedná se olátky homologní saprotininem (inhibitorem pankreatických enzymů). TFPI je inhibitorem zevní cesty koagulace. Nejdůležitějším zdrojem tohoto inhibitoru je endotel. Nejvyšší podíl TFPI (50–80%) je vázán na cévní stěnu amůže být uvolněn do oběhu po podání heparinu. Pro heparin obsahuje molekula TFPI vazebné místo svysokou afinitou (ovýznamu této reakce bude pojednáno vkapitole věnované léčbě heparinem). Zbylé množství volného TFPI (20–30%) cirkuluje vplazmě. Cílovými proteázami pro TFPI jsou F Xa aF VIIa. Zatímco funkce F Xa je inhibována přímo, kblokádě komplexu TF-F VIIa je požadována přítomnost F Xa akalciových iontů. Tato reakce probíhá ve dvou krocích: vprvním je vytvořen duální komplex TFPI/F Xa ave druhém kroku pak kvarterní komplex TFPI/F Xa/TF/F VIIa. Univerzálním inhibitorem blokujícím všechny koagulační faktory je alfa-2-makroglobulin.

1.1.3Fibrinolytický systém

Fibrinolytický systém je aktivován současně saktivací primární hemostázy akoagulační kaskády. To znamená, že tvorba trombu je primárním stimulem také kaktivaci fibrinolýzy. Fibrinolýza však probíhá podstatně pomaleji (48–72 hod. idéle). Hlavním úkolem systému (obr. 1.8) je včasné odstranění fibrinu zcévního řečiště atím opětovné zprůchodnění cévy. Je posledním regulačním proteolytickým mechanismem vhemostáze, který limituje tvorbu koagula tím, že rozpouští fibrin přítomný vtrombu aje zároveň reparačním mechanismem. Fibrin se degraduje proteolytickým enzymem plazminem, který vzniká aktivací plazminogenu. Plazminogen se endogenně aktivuje tkáňovým aktivátorem plazminogenu. Fyziologicky je působení plazminu omezeno na místa fibrinových depozit. Vlivem plazminu se fibrinogen rozpadá na produkty– tzv. fibrinogen-degradační produkty (FDP), které označujeme jako fragmenty X, Y (přechodné meziprodukty), D aE (hlavní, konečné produkty). Štěpení fibrinu probíhá déle než štěpení fibrinogenu, protože fibrin je proti plazminu relativně odolný. Stabilizací fibrinu faktorem XIIIa se vytvoří kovalentní vazby, které mají za následek, že se fragmenty X aY od sebe neuvolňují avznikají produkty YY/DXD, YD/DY, DD/E (obecně také označované jako FDP). Posledně jmenované (DD/E) jsou specifickým štěpným produktem fibrinu, známým jako D-dimery. Plazminogen se může aktivovat rovněž exogenně podáním urokinázy nebo streptokinázy adalšími trombolytiky. Fibrinolytický systém je udržován vrovnováze inhibitory plazminu, které snižují iriziko degradace systémového fibrinogenu. Hlavními inhibitory plazminu jsou alfa-2-antiplazmin aPAI-1. Vznikající FDP mohou rovněž inhibovat koagulaci, např. interferencí sagregací trombocytů.

Obr. 1.8 Systém fibrinolýzy

Závěrem této úvodní části je na přehledném obrázku (obr. 1.9) uveden systém krevního srážení tak, jak probíhá po poranění cévní stěny.

Jednotlivé inhibitory působí vrůzných částech koagulační kaskády. Kzástavě krvácení dochází vdůsledku tvorby primární zátky (trombu), která je tvořena agregátem krevních destiček. Zpevněním fibrinovými vlákny anáslednou retrakcí se vytváří definitivní koagulum. Systém plazmatických inhibitorů slouží kohraničení krevní zátky, kvytvoření efektivního agregátu trombocytů, rozpuštění vytvořené sraženiny, atím zprůchodnění cévy, což je hlavní úlohou fibrinolytického systému.

Obr. 1.9 Proces krevního srážení

Shrnutí – take home message

•Klasické dělení plazmatické části na vnitřní azevní je spíše didaktické, oba systémy jsou propojeny.

•Vnitřní cesta koagulace má vztah ikzánětu akomplementu.

•Trombocyty jsou velice komplikovanými elementy smnoha funkcemi.

•Hemostázu je nutno vnímat jako celek, včetně systému fibrinolytického.

•Dobrá znalost hemostázy je nezbytná pro pochopení laboratorní diagnostiky aklinické interpretace výsledků, stejně tak jako etiopatofyziologie jednotlivých chorob.

Literatura

Bain BJ, Bates I, Laffan MA, Lewis SM. Dacie and Lewis practical haematology. 11th ed. Philadelphia: Elsevier–Churchill Livingstone, 2012.

Baker CJ, Smith SA, Morrissey JH, et al. Polyphosphate in thrombosis, hemostasis, and inflammation. Res Pract Thromb Haemost. 2018;15;3(1):18–25. doi:10.1002/rth2.12162.

Barco S. The millennial generation of thrombosis and hemostasis. Hamostaseologie. 2020;40(3): 259–261. doi: 10.1055/a-1173-0662.

Berna-Erro A, Redondo PC, Lopez E, et al. Molecular interplay between platelets and the vascular wall in thrombosis and hemostasis. Curr Vasc Pharmacol. 2013;11(4):409–430. doi: 10.2174/1570161111311040006.

Bonar RA, Lippi G, Favaloro EJ, et al. Overview of hemostasis and thrombosis and contribution of laboratory testing to diagnosis and management of hemostasis and thrombosis disorders. Methods Mol Biol. 2017;1646:3–27. doi: 10.1007/978-1-4939-7196-1_1.

Broos K, Feys HB, De Meyer SF, et al. Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev. 2011;25(4):155–167. doi: 10.1016/j.blre.2011.03.002.

Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, et al. Hemostasis and thrombosis – basic principles and clinical practise. 1994, 3rd edition, J.B. Lippincott.

Conway EM. Reincarnation of ancient links between coagulation and complement. J Thromb Haemost. 2015;13:S121–S132.

Franco AT, Corken A, Ware J, et al. Platelets at the interface of thrombosis, inflammation, and cancer. Blood. 2015;30;126(5):582–588. doi: 10.1182/blood-2014-08-531582.

François P, Verstraeten L, Dinant JP, et al. The physiology of hemostasis: plasma and tissue factors in coagulation and fibrinolysis. J Pharm Belg. 1989;44(4):308–311. PMID: 2691642.

Holinstat M. Normal platelet function. Cancer Metastasis Rev. 2017;36(2):195–198. doi: 10.1007/s10555-017-9677-x.

Kattula S,Byrnes JR ,Wolberg AS.Fibrinogen and fibrin in hemostasis and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37(3):e130–e21. doi: 10.1161/ATVBAHA.117.308564.

Lasne D, Jude B, Susen S, et al. From normal to pathological hemostasis. Can J Anaesth. 2006;53(6Suppl):S2–11. doi: 10.1007/BF03022247.

Linden MD. Platelet physiology. Methods Mol Biol. 2013;992:13–30. doi: 10.1007/978-1-62703-339-8.

Lopes Da Silva M, Cutler DF. Von Willebrand factor multimerization and the polarity of secretory pathways in endothelial cells. Blood. 2016;128(2):277–285. doi: 10.1182/blood-2015-10-677054.

Mooberry MJ, Key NS. Microparticle analysis in disorders of hemostasis and thrombosis. Cytometry. 2016;89(2):111–122. doi: 10.1002/cyto.a.22647.

Riddel JP JR, Aouizerat BE, Miaskowski CH, et al. Theories of blood coagulation. J Pediatr Oncol Nurs. 2007;24(3):123–131. doi: 10.1177/1043454206298693.

Rinder HM. Hemostasis and coagulation. Clin Lab Med. 2009;29(2):xi. doi: 10.1016/j.cll.2009.06.0030.

Sakariassen KS, Bolhuis PA, Sixma JJ. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 1979;279(5714):636–638.

Sang Y, Roest M, De Laat B, et al. Interplay between platelets and coagulation. Blood Rev. 2021;46:100733. doi: 10.1016/j.blre.2020.100733.

Walsh PN. Platelet coagulation-protein interactions. Semin Thromb Hemost. 2004;30(4):461–471. doi: 10.1055/s-2004-833481.

1.2Laboratorní vyšetření hemostázy

Před vlastním laboratorním vyšetřením je nutno zdůraznit, že stejně důležitým krokem při vyšetření hemostázy je správná znalost jak rodinné, tak osobní anamnézy. Laboratorní testy mají různou senzitivitu aspecificitu, navíc jejich abnormální výsledky vždy neznamenají problémy klinické. Vyšetření hemostázy slouží kdiagnostice vrozených azískaných poruch hemostázy, ato jak stavů krvácivých, tak trombofilních. Laboratorní testy slouží také kmonitorování terapie antikoagulační (utrombotických stavů) iterapie substituční (vpřípadě léčby krvácivých chorob).

Kzískání správných hodnot při laboratorním vyšetřování je nutno dodržovat zásady správné laboratorní praxe. Zásady se týkají správného odběru krve (atraumaticky), použití správných zkumavek aantikoagulačního roztoku (zejména doporučovaného poměru odebrané krve aantikoagulačního roztoku) avčasného dodání vzorku do laboratoře (obr. 1.10).

Obr 1.10 Set pro vyšetření krve (laboratoř IV. interní kliniky FN HK)

Více než 90%nesprávných výsledků je způsobeno chybou vtéto „preanalytické“ fázi, nikoli při vlastním stanovení (obr. 1.11).

Obr. 1.11 Příklady špatného odběru krve (laboratoř IV. interní kliniky FN HK)

Koagulační testy lze dělit různě, např.

podle vyšetřovaného systému aspecificity vyšetření

1.Zhlediska vyšetřovaného systému

a)primární hemostáza,

b)plazmatická část koagulace,

c)vyšetření inhibitorů krevního srážení,

d)fibrinolytický systém.

2.Podle specificity vyšetření

a)Nespecifické, globální testy

•Testy neselektivní, které mohou být:

–globální, tj. postihující buď jeden celek (euglobulinová fibrinolýza), nebo více systémů (srážlivost),

–skupinové – screeningové (záchytné), které umožňují rozlišení např. poruch ve vnitřní či zevní cestě krevního srážení apod.

b)Specifické, cílené vyšetření

•Testy selektivní, které vyšetřují jednotlivé složky systémů koagulačních faktorů.

Při vyšetření hemostázy neselektivními skupinovými testy (např. protrombinový čas [PT], aktivovaný parciální tromboplastinový čas [aPTT]) si musíme uvědomit následující:

→Výsledky in vitro nemusí vždy odrážet stav in vivo. Čili jejich prodloužení nemusí vždy znamenat sklon ke krvácení, ale naopak sklon ktrombóze.

→Normální hodnoty nevylučují krvácivý stav.

Obecně platí, že dostupnými testy je snadnější apřesnější vyšetření plazmatické části koagulace než vyšetření primární hemostázy.

Laboratorní testy podle vyšetřovaného systému:

1.Vyšetření primární hemostázy

2.Vyšetření plazmatické části koagulace – tj. vnitřního či zevního systému společné cesty koagulace:

a)fibrinolýzy,

b)cirkulující protilátky – typu lupus anticoagulans (LA),

c)inhibitorů koagulačního faktoru.

1.2.1Vyšetření primární hemostázy

Kvyšetření primární hemostázy máme celou škálu testů, založených na naprosto odlišných principech. Liší se svou senzitivitou, specificitou, četností využití vklinické praxi (tudíž idostupností) acenou.

Vyšetření cévní stěny

Vyšetření rezistence kapilár (Rumpelův-Leedův test; obr. 1.12 a1.13). Hodnotí se počet petechií, které se vytvoří na ploše 16 cm^2 (na předloktí) po 10minutové kompresi manžetou tonometru při tlaku 80mmHg. Jako pozitivní se hodnotí nález ≥ 10petechií. Tento test je pozitivní utrombocytopenií, trombocytopatií, některých vaskulopatií či von Willebrandovy choroby.

Obr. 1.12 Vyšetření rezistence kapilár podle Rumpelova-Leedova testu (IV.interní hematologická klinika, FN HK)

Obr. 1.13 Hodnocení Rumpelova-Leedova testu (IV. interní hematologická klinika, FN HK)

Vyšetření rezistence kapilár petechiometrem (orientační)

Klobouček vývěvy přiložíme na předloktí, vytvoříme podtlak 300mmHg na dobu 45sekund aprovedeme odečtení petechií pod kloboučkem. Normální výsledek: počet petechií <10.

Test je pozitivní: ucévních purpur autrombocytopenií atrombocytopatií. Test může být pozitivní, ačkoliv je doba krvácivosti normální.

Vyšetření počtu trombocytů

Počet se většinou stanovuje na automatických analyzátorech krevních elementů současně sostatními parametry krevního obrazu. Analyzátory také dávají údaje ostředním objemu destičky (MPV – mean platelet volume), šíři distribuce destiček (PDW – platelet distribution width) adestičkovém hematokritu (plateletcrit). Tyto parametry lze využít vdiferenciální diagnostice trombocytopenií. Normální počet destiček závisí na typu analyzátoru avětšinou se pohybuje vrozpětí 150–400 × 10^9/l. Součástí vyšetření každé zjištěné trombocytopenie je prohlédnutí krevního nátěru kodlišení pseudotrombocytopenie při agregaci destiček způsobené EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) nebo při tzv. satelitním fenoménu (navázání destiček na neutrofily) (obr.1.14 a1.15).

Výhodná může být iznalost tzv. IPF (frakce nezralých trombocytů). To jsou mladé, 1–2 dny žijící, destičky světšími zbytky RNA. To dává informaci orychlosti trombopoezy vkostní dřeni. Diagnostický význam je zejména utrombocytopenií způsobených zvýšenou konzumpcí nebo při útlumu kostní dřeně (1–6,1%).

Obr. 1.14 Shluky trombocytů (laboratoř IV. interní hematologické kliniky FN HK)

Obr. 1.15 Destičkový satelitismus (laboratoř IV. interní hematologické kliniky FN HK)

Doba krvácivosti

Dobu krvácivosti můžeme měřit různým způsobem. Vzhledem knevyhovující standardizaci klasické metody podle Dukea se postupně objevily idalší metody.

Metoda podle Dukea

Sleduje se doba nutná kzástavě krvácení po standardním vpichu do ušního lalůčku nebo do patičky ukojence. Metoda (obr. 1.16) je méně přesná, dnes již používaná velmi zřídka, na našem pracovišti již vůbec.

Normální hodnota: 2–5min.

Prodloužená doba krvácivosti je utrombocytopenií, trombocytopatií – funkčních poruch destiček, uvon Willebrandovy choroby (vWD), při podávání léků sprotidestičkovým účinkem.

Obr. 1.16 Stanovení krvácivosti – Dukeův test (laboratoř IV. interní kliniky FN HK)

Metoda spoužitím standardní incize na předloktí (standardized template method)– Simplate

Předloktí na volární straně otřeme dezinfekčním roztokem. Na paži přiložíme manžetu tonometru anafoukneme na 40mmHg apři tomto tlaku udržujeme po celou dobu trvání testu. Vmístě bez patrných povrchových žil pevně přiložíme template se skalpelovým ostřím uzpůsobeným tak, že způsobí standardní incizi délky 9mm ahloubky 1mm.

Krev zlineární ranky odsáváme vpravidelných 15sekundových intervalech až do zástavy krvácení. Bohužel někdy zůstávají na předloktí drobné jizvy.

Normální hodnota: 3–9 min.

Prodloužená doba krvácivosti je utrombocytopenie, trombocytopatie, vWD vaskulopatie, afibrinogenemie, antiagregační terapie.

Vyšetření adhezivity trombocytů

Vyšetření adhezivity trombocytů se provádí různým způsobem. Jedním znejrozšířenějších testů je hodnocení adhezivity trombocytů na sklo. Počítá se počet adherovaných trombocytů na definované ploše sklíčka ponořeného do nativní krve či plazmy bohaté na trombocyty. Další možností je zjišťování retence trombocytů na sloupci skleněných kuliček. Abnormální výsledky dostáváme při trombocytopenii, trombocytopatii, antiagregační léčbě.

Agregace destiček

Princip metody tkví vtom, že se fotometricky měří agraficky zaznamenává intenzita světla procházejícího destičkami bohatou citrátovou plazmou po přidání příslušného induktoru (ADP, kolagen, adrenalin, trombin, ristocetin) nebo léku. Při agregaci destiček se plazma vyčeřuje aintenzita procházejícího světla se zvyšuje (obr. 1.17).

Obr. 1.17 Agregometr užívaný vnaší laboratoři (laboratoř IV. interní kliniky FN HK)

Agregace po ADP

ADP se váže na dva G-proteinem spojené receptory: P2Y1 aP2Y12 (obr. 1.18). Tato vazba vede kuvolnění intracelulárního vápníku azměně tvaru destičky, ato má za následek primární vlnu agregace. Druhá vlna agregace odráží uvolnění dalšího ADP ze zásobních granul destičky.

Obr. 1.18 Agregace po ADP (překreslil Jiří Hlaváček)

Agregace po trombinu

Trombin je nejúčinnější aktivátor destiček areceptorů aktivovaných proteázami (PAR). PAR1 aPAR4 jsou aktivovány trombinem. PAR1 aPAR4 patří do skupiny transmembránových G-proteinem spojených receptorů, které jsou aktivovány jedním štěpením na N-konci, tím se vytvoří nové N zakončení aaktivuje se G podjednotka adochází ksignalizaci do buňky.

Agregace po kolagenu

Kolagen se váže na receptory GP IVa aGP Ia indukující uvolňovací reakci, TXA2 generaci apak trvalou GP Ib agregaci aaktivaci.

Po přidání kolagenu kplazmě bohaté na destičky (PRP) lze pozorovat počáteční lag fázi na agregační křivce, ato obvykle do jedné minuty.

Agregace po ristocetinu

Ristocetin, pokud je navázaný na destičkový receptor GP Ib, působí aglutinaci destiček tím, že indukuje navázání vWF kGP Ib/IX, vkomplexu agregace vyžaduje vazbu fibrinogenu přes GP Iba komplex (ristocetin je antibiotikum).

Obr. 1.19 Agregační křivky (laboratoř IV. interní kliniky FN HK; postudium.cz)

Obr. 1.20 Kalibrační křivka

Agregace po arachidonové kyselině

Arachidonová kyselina je prekurzorem TXA2 uvnitř destiček. Arachidonová kyselina je převedena na TXA2 cyklooxygenázou atromboxan syntetázou. TXA2 je potenciálním induktorem agregace. Jednak se TXA2 uvolní zgranul, anavíc tvorba TXA2 následně trvale aktivuje GP IIb/III.

Agregační křivku pak zhodnotíme po jednotlivých agonistech (obr. 1.19), ato následující parametry:

•Maximální amplituda – maximální možná agregační odpověď, výpočet rozdílu transmise mezi plazmou chudou (PPP) aplazmou bohatou na destičky (PRP) v%.

•Maximální sklon – rychlost nárůstu transmise světla vdůsledku tvorby agregátů, výpočet = tangenta úhlu, který svírá křivka shodnotou transmise PRP.

•Doba latence – čas od přidání induktoru do doby změny transmise světla.

•Druhá vlna agregace (ADP – chybí porucha sekrece).

•Deagregace (porucha uvolňovací reakce).

Kalibrační křivka (obr. 1.20)

Baseline: PRP – 0% agregace. Přídavek agonisty – má za následek změnu tvaru destiček, atím dojde kpoklesu absorbance.

Primární agregační vlna: uvolnění nukleotidů (obr. 1.21).

Druhá vlna agregace: adrenalin amalé dávky ADP klasicky poskytují dvoufázové křivky (obr. 1.21), zatímco uostatních agonistů bývá vidět pouze jedna vlna aje nemožné rozlišit primární asekundární vlnu.

Fyziologické hodnoty

Maximální amplituda (obr. 1.22): 60–100% stimulovaná agregace (každá laboratoř má své vlastní hodnoty), 0–10% samovolná agregace.

Obr. 1.21 Agregační odpověď – 1. a2. vlna agregace

Obr. 1.22 Procento maximální agregace

Obr. 1.23 Agregační křivka, strmost křivky

Slope (obr. 1.23): monitorování ASA pomocí propylgalátu (dnes se používá velmi zřídka); nad 65%/min nedostatečná léčba, pod 35%/min nadměrná léčba.

Limitace agregačního vyšetření

1.Odběr musí být přísně nalačno.

2.Vyšetření musí být provedeno do 2hodin po odběru.

3.Vzorek není vhodné posílat potrubní poštou.

4.Počet trombocytů: ideálně vrozmezí 200–300 × 10^9/l. Počet destiček nižší než 100× 10^9/l může vést kzmenšení agregační odpovědi.

5.Hladina fibrinogenu.

6.Potraviny (česnek, kurkuma, ananas, ženšen, kofein aj.).

7.Kouření.

8.Chylózní plazma – interference tukových kapének při světelné transmisi.

9.Léky ovlivňující destičkové funkce: ASA, NSAID, specifické léky proti destičkám, léky, jejichž prvotní rolí není inhibovat funkci destiček – antibiotika, antidepresiva, betablokátory.

Závěrem nelze nezmínit prosté prohlédnutí krevního nátěru azhodnocení počtu amorfologie krevních destiček.

Měření doby přežívání destiček

Sleduje se zánik autologních destiček in vitro označených s^111In nebo 51Cr apřevedených zpět vyšetřovanému jedinci. Sleduje se snižování radioaktivity vodebíraných vzorcích vnásledujících dnech. Normální doba života destiček je 7–10 dnů.

Vyšetření retrakce koagula

Poskytuje informaci oretrakční schopnosti krevních destiček. Nejčastěji se provádí metoda retrakce koagula vdestičkami bohaté plazmě podle Benthause. Koagulum se při dostatečném počtu afunkci trombocytu retrahuje; čím větší je retrakční schopnost trombocytů, tím více séra se oddělí.

Vyšetření funkce trombocytů: systém PFA-100/200 (platelet function analyser)

Vyšetření funkce trombocytů pomocí systému PFA-100/200 (platelet function analyser) je dnes nejrozšířenější záchytný test pro vyšetření destičkových funkcí, zejména na interakci svWF. Systém je velmi senzitivní na adhezi aagregaci trombocytů závislou na vWF, GPIb, GPIIb/IIIa. Krev ze vzorku vyšetřovaného pacienta je aspirována do 2kartridží, potažených kolagenem/adrenalinem (primárně záchytné), resp.kolagenem aADP (adenosin 5‘-difosfátem), kterou lze identifikovat užití látek obsahujících kyselinu acetylsalicylovou. Je snahou napodobit situaci in vivo (smykové tření) azměřit čas do vytvoření krevní zátky. Normální rozmezí je vnaší laboratoři 78–145 sekund ukartridže skolagenem/adrenalinem a62–104 sekund ukartridže skolagenem aADP. PFA-100 má vysokou negativně prediktivní hodnotu (tab. 1.4), až na malé výjimky (primární defekt sekrece, mírná forma von Willebrandovy choroby typ 1).

Pokud je nález patologický, je indikováno vyšetření agregace trombocytů, event. vyšetření trombocytů průtokovou cytometrií. Stejně tak je nutné vyšetřit na přítomnost von Willebrandovy choroby.

Tab. 1.4 Interpretace nálezů při stanovení PFA-100

Onemocnění

Kolagen-ADP

Kolagen-adrenalin

Zdravý jedinec

N

N

Aspirin či NSAID

N

↑

Poruchy ADP receptoru či terapieklopidogrelem

N či ↑

N či ↑

Bernardův-Soulierův syndrom

↑

↑

Glanzmannova tromboastenie

↑

↑

von Willebrandova choroba

↑

↑

Destičkový typ vWD

↑

↑

Deficit denzních granul

N či ↑

N či ↑

Defekt primární sekrece

N či ↑

N či ↑

Syndrom „šedých“ destiček

↑

↑

MYH9 související onemocnění

N

↑

Scottův syndrom

N

N

MDS

N či ↑

N či ↑

Onemocnění jater

↑ [v. s. důsledkem ↓Hb]

↑ [v. s. důsledkem ↓Hb]

Uremie

↑ [v. s. důsledkem ↓Hb]

↑ [v. s. důsledkem ↓Hb]

Vyšetření trombocytů průtokovou cytometrií (CD znaky na povrchu trombocytu)

Pomocí průtokové cytometrie lze měřit akvantitativně stanovit CD (cluster of differentiation) markery na povrchu trombocytů, jednotlivé CD znaky odpovídají povrchovým glykoproteinům na destičce. To je možné využít k:

•detekci vrozených azískaných destičkových poruch,

•analýze aktivace trombocytů in vivo,

•transfuziologii,

•studiu doby obratu trombocytů.

Vyšetření destičkových nukleotidů

Zhruba 60% nukleotidů je obsaženo vdenzních granulech anení metabolicky aktivních, zbývajících 40% představuje metabolický „pool“. Jsou rozdíly vkoncentracích ADP aATP (adenosintrifosfát) vtěchto „poolech“ avýměna mezi nimi je velmi pomalá. Metabolický „pool“:poměr ATP : ADP je 8 : 1. Denzní granula: poměr ATP : ADP je 2 : 3. Vyšetření se vběžné klinické praxi neprovádí.

1.2.2Vyšetření plazmatické části koagulace (vnitřního či zevního systému, společné cesty koagulace)

Čas srážlivosti (globální test)

Čas srážlivosti (globální test) je doba, za kterou se srazí krev, která byla odebrána do 3zkumavek umístěných ve vodní lázni oteplotě 37 °C. Měří se doba srážení krve vkaždé ze3zkumavek aze získaných údajů se vypočte průměrná hodnota. Normální doba je 10min. Vdnešní době je tento test prakticky obsoletní. Pouze jeho modifikovaná metoda, aktivovaný čas srážení (ACT), se používá na kardiochirurgických sálech kesledování heparinizace. Kplné krvi se přidá aktivátor koagulace aměří se čas spoužitím speciálního přístroje ihned na sále.

Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT)

Slouží kvyšetření poruch zejména vnitřní cesty ataké společné cesty koagulace (obr.1.24).

Princip: Vyšetřujeme koagulaci citrátové plazmy po přidání kalcia, fosfolipidu (kefalinu) alátky umožňující aktivaci F XII kontaktem (kaolin, celit, kyselina ellagová). Normální hodnota závisí na kvalitě fosfolipidu alátky aktivující F XII. Pohybuje se mezi 35–45sekundami podle druhu reagens (obr. 1.24).

Za patologické se pokládá prodloužení ovíce než 10 sekund ve srovnání skontrolní hodnotou. Jinou možností je vyjadřovat výsledky jako poměr časů R (ratio), tj. času testované plazmy / času kontrolní plazmy. Za normálních podmínek se R pohybuje vrozmezí 0,8–1,2.

Obr. 1.24 Stanovení aPTT (medical.labs.net)

aPTT je prodlouženo:

1.Při nedostatku faktorů vnitřního srážecího systému (XII, XI, IX, VIII), spolu sPT při nedostatku faktorů X, V, II.

2.Při přítomnosti antitrombinové aktivity. Je vhodný kmonitorování antikoagulační léčby nefrakcionovaným heparinem (UFH). UFH jednoznačně prodlužuje aPTT, ale iPT je obvykle minimálně prodlouženo. To je zvýrazněno, pokud dojde kpřeantikoagulování.

3.aPTT se používá rovněž jako záchytný test na lupus anticoagulans (antifosfolipidové protilátky). PT může být také prodloužen, ale je to velmi neobvyklé, vzhledem kvysokému obsahu fosfolipidů vreagencii.

4.Při terapii DOAC (direct oral anticoagulant) – dabigatranem.

Vpřípadě prodlouženého aPTT provádíme tzv. korekci, tedy přidáme stejné množství normální plazmy aznovu měříme aPTT. Někdy stanovení opakujeme po inkubaci 1či 2 hodin.

Diferenciální diagnóza prodlouženého aPTT je na obrázku 1.25.

Stran korekčních testů existují ijiná doporučení, např. dle Changa, kdy při poměru 4:1(aPTT nemocného/kontroly) se procento korekce vypočítává podle následujícího vzorce:

N = čas aPTT nemocného, K= čas kontrolní plazmy

Obr. 1.25 Diferenciální diagnóza prodlouženého aPTT

Toto stanovení má dobrou specificitu isenzitivitu pro detekci LA či deficitu faktoru. Interpretace výsledků je ukázána vtabulce 1.5.

Vklinice má určitý význam inález zkráceného aPTT, protože svědčí pro větší pohotovost ktrombóze. Je to dáno vysokou aktivitou F VIII. Předpokladem pro interpretaci je vyloučení arteficiálního zkrácení díky aktivaci koagulace při obtížném odběru krve.

Pokud nehodnotíme jen čas získaný při stanovení aPTT, ale ifotovizuálně, můžeme dostat některé další informace podle charakteru vlny, např. bifázické vlny při syndromu diseminované intravaskulární koagulace (DIC; obr. 1.26 a1.27). Ktomu je nutný patřičný analyzátor. Tato abnormální vlna je dána komplexem C-reaktivního proteinu (CRP) alipoproteinu ovelmi nízké denzitě (VLDL). Stanovení je senzitivní pro diagnostiku DIC, ale specificita je nižší. Toto stanovení nedosáhlo širšího klinického využití.

Jakmile dojde kvytvoření krevní sraženiny, dojde kpoklesu optické průchodnosti.

Tab. 1.5 Interpretace aPTT umixu 4 : 1

Okamžitá korekce v%

% korekce po inkubaci

Procento korekce je suspektní z:

≥ 50 %

> 10 %

deficitu faktoru

< 50 %

>10 %

mírného deficitu faktoru

≥ 50 %

≤ 10 %

inhibitoru faktoru

< 50 %

≤ 10 %

LA

Obr. 1.26 Normální křivka, křivka při diseminované intravaskulární koagulaci

Obr. 1.27 Srovnání nálezů

Tromboplastinový čas (protrombinový čas, Quickův test, PT)

Tento test byl poprvé popsán Quickem vr. 1935, proto se dodnes používá termín Quickův čas (obr. 1.28).

Princip: Měří se doba srážení citrátové plazmy po přidání tromboplastinu (TF) akalcia. Normální hodnota: 14–15 sekund.

Trombinový čas(TT)

Stanovení fibrinogenu

Reptilázový čas

aPTT

PT

N

Kvantitativní stanovení faktorů VIII, IX, XI, XII

Kvantitativní stanovení faktorů II, V, VII aX

1.2.3Vyšetření fibrinolýzy

Čas euglobulinové fibrinolýzy

D-dimery

Stanovení degradačních produktů fibrinu afibrinogenu – FDP

Vyšetření změn fibrinogeneze

Speciální vyšetření změn fibrinolýzy

Metoda rotační tromboelastografie (ROTEM)

Trombin-generační test (TGT)

Stanovení INR aaPTT metodou POCT

1.2.4Vyšetření trombofilních stavů

Stanovení antitrombinu

Vyšetření proteinu C

Stanovení proteinuS

Stanovení rezistence kaktivovanému proteinuC (APC)

ProC Global

Vyšetření protilátky typu lupus anticoagulans (LA)

Shrnutí – take home message

Literatura

Table of Contents

Předmluva

1 Teoretická část

1.1 Základní principy hemostázy

1.1.1 Primární hemostáza

Morfologie trombocytů

Úloha trombocytů v primární hemostáze

Úloha trombocytů v plazmatické koagulaci

1.1.2 Plazmatická část koagulace

Koagulační faktory

Přirozené inhibitory koagulace

1.1.3 Fibrinolytický systém

Shrnutí – take home message

Literatura

1.2 Laboratorní vyšetření hemostázy

1.2.1 Vyšetření primární hemostázy

Vyšetření cévní stěny

Vyšetření počtu trombocytů

Doba krvácivosti

Vyšetření adhezivity trombocytů

Agregace destiček

Měření doby přežívání destiček

Vyšetření retrakce koagula

Vyšetření funkce trombocytů: systém PFA-100/200 (platelet function analyser)

Vyšetření trombocytů průtokovou cytometrií (CD znaky na povrchu trombocytu)

Vyšetření destičkových nukleotidů

1.2.2 Vyšetření plazmatické části koagulace (vnitřního či zevního systému, společné cesty koagulace)

Čas srážlivosti (globální test)

Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT)

Tromboplastinový čas (protrombinový čas, Quickův test, PT)

Trombinový čas (TT)

Stanovení fibrinogenu

Reptilázový čas

Kvantitativní stanovení faktorů VIII, IX, XI, XII

Kvantitativní stanovení faktorů II, V, VII a X

1.2.3 Vyšetření fibrinolýzy

Čas euglobulinové fibrinolýzy

D-dimery

Stanovení degradačních produktů fibrinu a fibrinogenu – FDP

Vyšetření změn fibrinogeneze

Speciální vyšetření změn fibrinolýzy

Metoda rotační tromboelastografie (ROTEM)

Trombin-generační test (TGT)

Stanovení INR a aPTT metodou POCT

1.2.4 Vyšetření trombofilních stavů

Stanovení antitrombinu

Vyšetření proteinu C

Stanovení proteinu S

Stanovení rezistence k aktivovanému proteinu C (APC)

ProC Global

Vyšetření protilátky typu lupus anticoagulans (LA)

Shrnutí – take home message

Literatura